Esta técnica se puede utilizar para generar esferoides celulares a partir de tipos de células individuales y múltiples utilizando una plataforma de laboratorio en un CD, un sistema pionero para la rápida generación de esferoides. La técnica utiliza la fuerza centrífuga para depositar células en micropocillos designados, permitiendo la euforia secuencial de múltiples tipos de células para la producción de diversos esferoides. Para la fabricación de virutas de cultivo CMS, primero cree moldes de policarbonato para las capas superior e inferior del chip de cultivo mediante mecanizado de control numérico por computadora.
A continuación, mezcle la base de PDMS y el agente de curado PDMS en una proporción de 10 a una durante cinco minutos antes de colocar la mezcla en un desecador durante una hora para eliminar las burbujas de aire. Vierta la mezcla de PDMS desgasificación en los moldes de viruta de cultivo CMS y coloque los moldes en el desecador durante una hora más para eliminar cualquier burbuja de aire. Al final de la segunda desgasificación, curar la mezcla en una cámara de calor a 80 grados Celsius durante dos horas antes de colocar las virutas en una limpiadora de plasma aspirada con las superficies a unir hacia arriba.
Exponga los chips de cultivo al plasma asistido por aire a una potencia de 18 vatios durante 30 segundos, y unir las dos capas del chip en la cámara de calor a 80 grados centígrados durante 30 minutos para aumentar la resistencia a la adhesión. A continuación, esterilizar el chip de cultivo CMS en un autoclave a 121 grados Celsius durante 15 minutos. Para preparar las células para la formación de esferoides, descongele un vial de un mililitro que contenga de cinco a 10 veces 10 a las cinco células de interés en un baño de agua de 36,5 grados Centígrados durante dos minutos antes de agregar un mililitro de DMEM a las células con una mezcla suave.
A continuación, agregue las células a un plato petri de 150 milímetros de diámetro que contenga 15 mililitros de 36,5 grados de medio centígrado, y coloque el plato en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace el sobrenadante con 15 mililitros de DMEM fresco, y devuelva las células a la incubadora. Para separar las células, crea el cultivo con cuatro mililitros de trippsina durante cuatro minutos a 36,5 grados Centígrados y un 5% de dióxido de carbono, deteniendo la reacción con medio fresco cuando las células se han levantado de la parte inferior del plato.
Para etiquetar las células, caliente un tinte de fluorescencia celular adecuado a temperatura ambiente antes de agregar 20 microlitros de sulfóxido de dimetil anhidro al vial para obtener una solución de un milimolar. Diluir la fluorescencia a una concentración de trabajo final de un micromolar en DMEM, y añadir el tinte a la suspensión celular de interés con una mezcla suave. Luego coloque las células en la incubadora de cultivo celular durante 20 minutos.
Para la formación de esferoides monocultivos, primero agregue 2,5 mililitros de solución 4%Plurónica F-127 al orificio de entrada del chip de cultivo CMS mientras gira el chip a 500 a 1.000 rotaciones por minuto. Cuando se haya añadido toda la solución, gire el chip a 4.000 rotaciones por minuto durante tres minutos utilizando el sistema CMS. Al final de la rotación, incubar el chip de cultivo durante la noche a 36,5 grados centígrados a un 5% de dióxido de carbono.
A la mañana siguiente, retire la solución Pluronic y lave el chip de cultivo con DMEM. Después de secar el chip durante 12 horas en un banco limpio, agregue 2,5 mililitros del medio al puerto de entrada y gire el chip a 4.000 rotaciones por minuto durante tres minutos. Al final de la rotación, sustituya 100 microlitros del medio en el puerto de entrada por 100 microlitros de la suspensión de celda preparada, mientras que el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto.
Luego gire el chip a 3.000 rotaciones por minuto durante tres minutos durante tres minutos para atrapar las células en cada micropocillos por fuerza centrífuga antes de colocar el chip en la incubadora de cultivo celular durante tres días, actualizando el medio como se demuestra todos los días. Para la generación de cocultura esferoides concéntrica, agregue la primera población de células en 100 microlitros de medio al puerto de entrada del chip mientras el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto seguidas de tres minutos de rotación a 3.000 rotaciones por minuto. Al final de la rotación, agregue 100 microlitros de la segunda población de células mientras el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto, y gire el chip a 3.000 rotaciones por minuto durante otros tres minutos.
Cuando se hayan inyectado ambos volúmenes de células, coloque el chip en la incubadora de cultivo celular en 1.000 a 2.000 rotaciones por minuto durante 24 horas. Para la formación de esferoides Janus, agregue 100 microlitros de la primera población de células mientras el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto seguido de tres minutos a 3.000 rotaciones por minuto. Al final de la rotación, coloque el chip en la incubadora de cultivo celular para la rotación en 1.000 a 2.000 rotaciones por minuto durante tres horas.
Al final de la incubación, agregue 100 microlitros de la segunda población de células mientras que el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto antes de girar el chip a 3.000 rotaciones por minuto durante tres minutos. Luego coloque las células en la incubadora de cultivo celular en 1.000 a 2.000 rotaciones por minuto durante 24 horas. Para la formación de esferoides sándwich, primero agregue 100 microlitros de la primera población celular mientras el chip está girando a 500 a 1.000 rotaciones por minuto seguido de tres minutos de rotación a 3.000 rotaciones por minuto.
Al final de la rotación, coloque el chip en un rotador en la incubadora de cultivo celular durante dos horas a 1.000 a 2.000 rotaciones por minuto antes de agregar 100 microlitros de la segunda población de células mientras el chip está girando a 500 a 1.000 rotaciones por minuto. Gire el chip a 3.000 RPM durante tres minutos y vuelva a colocar el chip en la incubadora para una incubación de tres horas con rotación. Luego agregue 100 microlitros adicionales de la primera población celular mientras que el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto, y gire y haga cultivo de las células como se acaba de demostrar durante 12 horas.
Siguiendo el protocolo como se ha demostrado, un chip de cultivo CMS de seis centímetros de diámetro se puede fabricar con éxito. El canal del chip de cultivo CMS comprende un puerto de entrada y regiones centrales, de diapositivas y de micropocillos. Las imágenes de lapso de tiempo de dos tipos de cultivo celular tomadas a 2.000 rotaciones por minuto durante las primeras 24 horas de cultivo dentro de chips CMS individuales, como se ha demostrado, muestran la formación exitosa de esferoides.
Las imágenes de los micropocillos después de tres días de cultivo muestran que los esferoides demuestran una excelente uniformidad y esfericidad. También se pueden generar esferoides cocultivos con estructuras conenestricales, Janus y sándwiches. Además, los cultivos celulares expuestos a alta gravedad durante siete días, seguidos de manchas vivas/muertas, demuestran que la mayoría de las células sobreviven al cultivo a largo plazo dentro de los chips.
Las capas superior e inferior del chip de cultivo CMS deben alinearse cuidadosamente cuando están unidas, de lo contrario el número de células en cada micropozo puede no ser igual. Este estudio puede reducir la barrera de entrada para la investigación del esferoide de cocultura y puede ser ampliamente utilizado en estudios de cocultura, por ejemplo, para la detección de nuevos fármacos de interés.
