Los cambios mitocondriales desempeñan un papel importante en los cánceres de ovario humanos. Este protocolo establece una plataforma eficaz para aislar y purificar las mitocondrias del cáncer de ovario humano y los tejidos de control para el análisis proteómico a gran escala. Las mitocondrias, como centros de metabolismo energético, señalización celular y estrés oxidativo, la comprensión de los cambios de proteoma mitocondrial en los cánceres de ovario benefician a nuestro mecanismo molecular de comprensión, y es un descubrimiento de biomarcadores eficaces y las dianas terapéuticas.
Esta técnica utiliza centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación de gradiente de densidad para separar las mitocondrias del cáncer de ovario humano en los tejidos de control, lo que resulta en muestras de mitocondrias de alta calidad para el análisis proteómico cuantitativo. La preparación de las mitocondrias, junto con la proteómica cuantitativa iTRAQ, se han utilizado con éxito en el análisis del tejido canceroso ovárico humano, que se traduce fácilmente para analizar otros tejidos, mitocondrias proteómicas. Aquellos que nunca han realizado este método pueden encontrar que puede ser difícil aislar las mitocondrias del control de ovarios que los tejidos cancerosos.
Es necesario añadir una trippsina para mejorar la homogeneización del tejido de control y añadir una capa adicional de gradiente de densidad medio para mejorar la separación de las mitocondrias. Para comenzar este procedimiento, prepare 250 mililitros del búfer de aislamiento mitocondrial como se describe en el protocolo de texto. Coloque aproximadamente 1,5 gramos de tejidos cancerosos de ovario en un plato de vidrio limpio.
Agregue dos mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial pre-refrigerado para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido. Repita este lavado tres veces. Luego, utilice tijeras oftálmicas limpias para picar completamente el tejido en pedazos que son aproximadamente un milímetro cúbico, y transfiera los tejidos picados en un tubo centrífugo de 50 mililitros.
Añadir 13,5 mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial que contenga nagarse a una concentración de 0,2 miligramos por mililitro. Utilice un homogeneizador electrónico para homogeneizar los tejidos picados durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Después de esto, añadir otros tres mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial al tejido homogeneizar y mezclarlos bien por pipeteo.
Centrifugar el tejido preparado homogeneizar a 1,300 xg, y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Retire el pellet y mantenga el sobrenadante. A continuación, centrifugar el sobrenadante a 10.000 xg y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Retire el sobrenadante que contiene microsomas y conserve el pellet. Añadir 2 mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial y volver a suspender el pellet a fondo por pipeteo ligero. Centrifugar esta suspensión de pellets a 7.000 xg y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante y conserve el pellet, que contiene las mitocondrias crudas. Añadir 12 mililitros de 25% de densidad de gradiente medio para volver a suspender las mitocondrias brutas extraídas. Haga un gradiente de densidad discontinua que contenga las mitocondrias brutas re-suspendidas como se describe en el protocolo de texto, y centrifugarlo a 52.000 xg, y a cuatro grados celsius durante 90 minutos.
Utilice una jeringa larga y contundente para recoger las mitocondrias purificadas en la interfaz entre los medios de 25% y 30% gradiente, y transfiera esto a un tubo limpio. Añadir tampón de aislamiento mitocondrial a las mitocondrias recogidas para diluirlo a un volumen triple. Centrifugar a 15.000 xg, y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
Deseche el sobrenadante y conserve el pellet. Recoger el pellet final que contiene las mitocondrias purificadas, y almacenarlo en 20 grados Celsius. En primer lugar, prepare 250 mililitros del búfer de aislamiento mitocondrial como se describe en el protocolo de texto.
Añadir aproximadamente 1,5 gramos de los tejidos ováricos de control normal a un plato de vidrio limpio. Agregue dos mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial pre-refrigerado para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido. Repita este lavado tres veces.
Usando tijeras oftálmicas limpias, pica completamente el tejido en pedazos que son aproximadamente 1 milímetro cúbico, y transferir los tejidos picados en un tubo limpio de 50 mililitros. Añadir ocho mililitros de una solución que contenga 0,05%príspsina y 20 mililitros de EDTA y PBS a los tejidos de control picados, y digerir a temperatura ambiente durante 30 minutos para ayudar a anlicer las células y liberar las mitocondrias. Centrifugar a 200 xg durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y conserve los tejidos y las células. Añadir 13,5 mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial que contenga nagarse a una concentración de 0,2 miligramos por mililitro, y utilizar un homogeneizador eléctrico para homogeneizar los tejidos picados a cuatro grados Celsius durante dos minutos. Añadir otros tres mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial al tejido homogeneizado y mezclar a fondo por pipeteo.
Centrifugar el tejido preparado homogeneizar a 1,300 xg y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Retire el pellet y mantenga el sobrenadante. Centrifugar el sobrenadante a 10.000 xg y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Retire el sobrenadante, que contiene los microsomas, y conserve el pellet. A continuación, agregue 2 mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial y vuelva a suspender el pellet a fondo por pipeteo ligero. Centrifugar esta suspensión de pellets a 7.000 xg y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante y conserve el pellet que contiene las mitocondrias crudas. Añadir 12 mililitros de 25% de densidad de gradiente medio para volver a suspender las mitocondrias brutas extraídas. Haga un gradiente de densidad discontinua que contenga las mitocondrias brutas como se describe en el protocolo de texto, y centrifugarlo a 52.000 xg y a cuatro grados centígrados durante 90 minutos.
Utilice una jeringa larga y contundente para recoger las mitocondrias purificadas en el rango desde la interfaz entre los medios de 25 y 30% gradiente hasta la interfaz entre los medios de 34 y 38% gradiente. Transfiera las mitocondrias purificadas a un tubo limpio. Añadir tampón de aislamiento mitocondrial a las mitocondrias recogidas para diluirlo a un volumen triple.
Centrifugar a 15.000 xg y a cuatro grados Celsius durante 20 minutos, y deseche el sobrenadante. Añadir 2 mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial para volver a suspender el pellet y la centrífuga a 15.000 xg y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y conserve el pellet.
Recoger el pellet final y almacenarlo a 20 grados Celsius. En este estudio, las muestras mitocondriales de alta calidad se preparan a partir de cáncer de ovario humano y tejidos de control para proteómica cuantitativa a gran escala. Hay algunas diferencias en la preparación de las mitocondrias a partir de tejidos cancerosos de ovario y controlar los tejidos ováricos, incluyendo el uso de un gradiente de densidad discontinua diferente.
Después de la centrifugación, las mitocondrias purificadas de los tejidos cancerosos de ovario se encuentran en la interfaz entre 25% y 30%, mientras que las de los tejidos ováricos de control se encuentran en el rango desde la interfaz entre 25% y 30%a la interfaz entre 34% y 38%La calidad de las mitocondrias preparadas se evalúa luego con centrifugación de velocidad diferencial y centrifugación de densidad de densidad gradientugación a través de la microscopía de electrones. Las imágenes del microscopio electrónico demuestran que tanto en los cánceres de ovario como en los tejidos ováricos de control, los orgánulos principales aislados son mitocondrias, excepto por una pequeña cantidad de peroxisomas. Sin embargo, se observa que la morfología de las mitocondrias cambia más en los cánceres de ovario que controla el tejido ovárico.
La calidad de las mitocondrias preparadas también se evalúa a través de la mancha occidental. Las imágenes de manchas occidentales también demuestran que el componente principal en las muestras mitocondriales preparadas de cánceres de ovario y ovarios de control son las mitocondrias, excepto por una pequeña cantidad de peroxisomas, que es consistente con el análisis de microscopía electrónica. Es razonable que los peroxisomas estén contenidos en las mitocondrias preparadas, porque las mitocondrias interactúan ampliamente con los peroxisomas, lo que a su vez refleja la integridad funcional de las mitocondrias.
Estos resultados demuestran la alta calidad de las muestras mitocondriales preparadas. Cuando estoy realizando este procedimiento, es muy importante que picar completamente los tejidos antes de la homogeneización, y añadir la tripina a los tejidos de control picados. También es importante que hagas o prepares un gradiente de densidad discontinua para las muestras de cáncer y los controles.
Después de este procedimiento, se puede realizar proteómica cuantitativa o fosfoproteómica iTRAQ o TMT para aclarar el perfil de los mitocondes del cáncer de ovario, y se puede establecer un perfil de fosfoproteoma para aclarar las funciones de las mitocondrias en el cáncer de ovario en grandes profundidades. Esta técnica allana el camino para que los investigadores estudien sistemáticamente el proteoma de las mitocondrias y el fosfoproteoma en el cáncer de ovario, construyan el sistema de red de la vía de señalización y descubran los biomarcadores fiables y las dianas terapéuticas.
