Mitochondriale Veränderungen spielen eine wichtige Rolle bei menschlichen Eierstockkrebs. Dieses Protokoll schafft eine effektive Plattform, um Mitochondrien von menschlichem Eierstockkrebs und den Kontrollgeweben für groß angelegte Proteomik-Analysen zu isolieren und zu reinigen. Mitochondrien, als Zentren des Energiestoffwechsels, Zellsignalisierung, und oxidativen Stress, Einblicke in mitochondriale Proteom-Änderungen bei Eierstockkrebs profitieren von unserem Verständnis molekularen Mechanismus, und ist eine Entdeckung der effektiven Biomarker und die therapeutischen Ziele.
Diese Technik verwendet Differential-Speed-Zentrifugation in Kombination mit Dichtegradientzentrifugation, um Mitochondrien von menschlichem Eierstockkrebs in den Kontrollgeweben zu trennen, was zu hochwertigen Mitochondrienproben für die quantitative Proteomikanalyse führt. Das Mitochondrienpräparat, gekoppelt mit der quantitativen iTRAQ-Proteomik, wurde erfolgreich bei der Analyse des menschlichen Eierstockkrebsgewebes eingesetzt, was leicht übersetzt andere Gewebe, Mitochondrienproteomik, analysiert. Diejenigen, die diese Methode noch nie durchgeführt haben, können feststellen, dass es schwierig sein kann, Mitochondrien von der Eierstockkontrolle zu isolieren als Krebsgewebe.
Es ist notwendig, ein Trypsin hinzuzufügen, um die Homogenisierung des Kontrollgewebes zu verbessern und eine zusätzliche Schicht des Dichtegradientenmediums hinzuzufügen, um die Mitochondrientrennung zu verbessern. Bereiten Sie zum Starten dieses Verfahrens 250 Milliliter des mitochondrialen Isolationspuffers vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie etwa 1,5 Gramm Eierstockkrebsgewebe in eine saubere Glasschale.
Fügen Sie zwei Milliliter vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Blut leicht von der Gewebeoberfläche zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Verwenden Sie dann eine saubere Augenschere, um das Gewebe vollständig in Stücke zu zerkleinern, die etwa einen Kubikmillimeter groß sind, und übertragen Sie das gehackte Gewebe in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr.
Fügen Sie 13,5 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer mit Nagarse bei einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter hinzu. Verwenden Sie einen elektronischen Homogenisator, um das Hackfleisch für zwei Minuten bei vier Grad Celsius zu homogenisieren. Danach fügen Sie weitere drei Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer in die Gewebehomogenate und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.
Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe bei 1, 300 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie das Pellet und halten Sie den Überstand. Als nächstes zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entfernen Sie den mikrosomenhaltigen Überstand und bewahren Sie das Pellet auf. Fügen Sie 2 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer hinzu und setzen Sie das Pellet gründlich durch leichte Pipettierung wieder auf. Zentrifugieren Sie diese Pelletsuspension bei 7.000 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf, das die rohen Mitochondrien enthält. Fügen Sie 12 Milliliter des 25%Dichte Gradienten medium, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen. Erstellen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, der die im Textprotokoll beschriebenen wieder aufgehängten rohen Mitochondrien enthält, und zentrifugieren Sie ihn 90 Minuten lang bei 52.000 xg und bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien an der Schnittstelle zwischen den 25% und 30%Gradientenmedien zu sammeln und diese auf ein sauberes Rohr zu übertragen. Fügen Sie den gesammelten Mitochondrien einen mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um ihn auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen. Zentrifuge bei 15.000 xg und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf. Sammeln Sie das letzte Pellet, das die gereinigten Mitochondrien enthält, und lagern Sie es bei 20 Grad Celsius. Bereiten Sie zunächst 250 Milliliter des mitochondrialen Isolationspuffers vor, wie im Textprotokoll beschrieben.
Etwa 1,5 Gramm des normalen Kontroll-Ovarialgewebes zu einer sauberen Glasschale geben. Fügen Sie zwei Milliliter vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Blut leicht von der Gewebeoberfläche zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal.
Mit einer sauberen Augenschere das Gewebe vollständig in Stücke zerkleinern, die etwa 1 Kubikmillimeter groß sind, und das hackfleischte Gewebe in ein sauberes 50-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie acht Milliliter einer Lösung, die 0,05%Trypsin und 20 Millimolar EDTA und PBS enthält, in das gehackte Kontrollgewebe und verdauen Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um die Zellen zu lysieren und die Mitochondrien freizusetzen. Zentrifuge bei 200 xg für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die Gewebe und Zellen auf. Fügen Sie 13,5 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer mit Nagarse bei einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter hinzu und verwenden Sie einen elektrischen Homogenisator, um das hackfleischige Gewebe bei vier Grad Celsius für zwei Minuten zu homogenisieren. Fügen Sie weitere drei Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer in das Gewebe homogenate und mischen Sie gründlich durch Pipettieren.
Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe bei 1, 300 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie das Pellet und halten Sie den Überstand. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand, der die Mikrosomen enthält, und halten Sie das Pellet. Fügen Sie dann 2 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer hinzu und setzen Sie das Pellet gründlich durch leichte Pipettierung wieder auf. Zentrifugieren Sie diese Pelletsuspension bei 7.000 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf, das die rohen Mitochondrien enthält. Fügen Sie 12 Milliliter des 25%Dichte Gradienten medium, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen. Machen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, der die rohen Mitochondrien enthält, wie im Textprotokoll beschrieben, und zentrifugieren Sie sie 90 Minuten lang bei 52.000 xg und bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien im Bereich von der Schnittstelle zwischen den 25- und 30%Gradientenmedien bis zur Schnittstelle zwischen den 34- und 38%gradienten Medien zu sammeln. Die gereinigten Mitochondrien in ein sauberes Rohr geben. Fügen Sie den gesammelten Mitochondrien einen mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um ihn auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen.
Zentrifugieren Sie bei 15.000 xg und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 2 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet und die Zentrifuge bei 15.000 xg und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten wieder aufzuhängen. Entsorgen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet.
Sammeln Sie das letzte Pellet und lagern Sie es bei 20 Grad Celsius. In dieser Studie werden hochwertige mitochondriale Proben aus menschlichem Eierstockkrebs und Kontrollgewebe für groß angelegte quantitative Proteomik hergestellt. Es gibt einige Unterschiede in der Herstellung der Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Eierstockgeweben, einschließlich der Verwendung eines anderen diskontinuierlichen Dichtegradienten.
Nach der Zentrifugation finden sich die gereinigten Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben an der Schnittstelle zwischen 25% und 30%, während die aus kontrollierbaren Eierstockgeweben im Bereich von der Schnittstelle zwischen 25% und 30% bis zur Schnittstelle zwischen 34% und 38% gefunden werden Die Qualität der hergestellten Mitochondrien wird dann mit Differentialgeschwindigkeitszentrifugation und Dichtegradientenzentrifugation mittels Elektronenmikroskopie bewertet. Die Elektronenmikroskop-Bilder zeigen, dass bei Eierstockkrebs und Kontrolle des Eierstockgewebes die wichtigsten isolierten Organellen Mitochondrien sind, mit Ausnahme einer geringen Menge peroxisomen. Jedoch, die Morphologie der Mitochondrien wird gesehen, um mehr bei Eierstockkrebs zu ändern, als Eierstockgewebe zu kontrollieren.
Die Qualität der zubereiteten Mitochondrien wird auch über den westlichen Fleck bewertet. Die westlichen Blot-Bilder zeigen auch, dass die Hauptkomponente in vorbereiteten mitochondrialen Proben von Eierstockkrebs und Eierstöcken Mitochondrien ist, mit Ausnahme einer kleinen Menge von Peroxisomen, die mit der Elektronenmikroskopie-Analyse übereinstimmt. Es ist vernünftig, dass Peroxisomen in den vorbereiteten Mitochondrien enthalten sind, da Mitochondrien ausgiebig mit Peroxisomen interagieren, was wiederum die funktionelle Vollständigkeit der Mitochondrien widerspiegelt.
Diese Ergebnisse zeigen die hohe Qualität der vorbereiteten mitochondrialen Proben. Wenn ich dieses Verfahren durcharbeite, ist es sehr wichtig, dass Sie Gewebe vor der Homogenisierung vollständig zerkleinern und das Trypsin zu den gehackten Kontrollgeweben hinzufügen. Es ist auch wichtig, dass Sie diskontinuierliche Dichte Gradient für die Krebsproben und die Kontrollen zu machen und vorbereitet.
Nach diesem Verfahren können iTRAQ oder TMT quantitative Proteomik oder Phosphoproteomik durchgeführt werden, um das Profil des Ovarialkarzinoms Mitochondrienproteom zu klären, und phosphoproteomeprofil kann erstellt werden, um die Rolle von Mitochondrien bei Eierstockkrebs in großen Tiefen zu klären. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, mitochondopienproteom und das Phosphoprotelom bei Eierstockkrebs systematisch zu untersuchen, das Signalweg-Netzwerksystem zu konstruieren und die zuverlässigen Biomarker und die therapeutischen Ziele zu entdecken.
