Mudanças mitocondriais desempenham papéis importantes nos cânceres de ovário humanos. Este protocolo estabelece uma plataforma eficaz para isolar e purificar mitocôndrias do câncer de ovário humano e os tecidos de controle para análise de proteômica em larga escala. Mitocôndrias, como centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo, a visão sobre as mudanças mitocondriais proteome nos cânceres de ovário beneficiam nosso mecanismo molecular compreensivo, e é uma descoberta de biomarcadores eficazes e alvos terapêuticos.
Esta técnica utiliza centrifugação de velocidade diferencial em combinação com centrífuga gradiente de densidade para separar mitocôndrias do câncer de ovário humano nos tecidos de controle, o que resulta em amostras de mitocôndrias de alta qualidade para análise quantitativa de proteômica. A preparação das mitocôndrias, juntamente com a proteômica quantitativa iTRAQ, tem sido usada com sucesso na análise do tecido do câncer de ovário humano, que se traduz facilmente para analisar outros tecidos, mitocôndrias proteômicas. Aqueles que nunca realizaram esse método podem achar que pode ser difícil isolar mitocôndrias do controle ovariano do que os tecidos cancerígenos.
É necessário adicionar uma trippsina para melhorar a homogeneização do tecido de controle e adicionar uma camada extra de meio gradiente de densidade para melhorar a separação das mitocôndrias. Para iniciar este procedimento, prepare 250 mililitros do tampão de isolamento mitocondrial conforme descrito no protocolo de texto. Coloque aproximadamente 1,5 gramas de tecidos de câncer de ovário em um prato de vidro limpo.
Adicione dois mililitros de tampão de isolamento mitocondrial pré-resfriado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido. Repita esta lavagem três vezes. Em seguida, use uma tesoura oftálmica limpa para picadinho total do tecido em pedaços que são aproximadamente um milímetro cúbico, e transfira os tecidos picados para um tubo de centrífugo de 50 mililitros.
Adicione 13,5 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial contendo nagarse a uma concentração de 0,2 miligramas por mililitro. Use um homogeneizador eletrônico para homogeneizar os tecidos picados por dois minutos a quatro graus Celsius. Depois disso, adicione mais três mililitros de tampão de isolamento mitocondrial ao tecido homogeneiza e misture-os bem por pipetação.
Centrifugar o tecido preparado homogeneizar a 1.300 xg, e a quatro graus Celsius por 10 minutos. Retire a pelota e mantenha o supernatante. Em seguida, centrifugar o supernante a 10.000 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Remova o supernanato contendo microsóbios e mantenha a pelota. Adicione 2 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial e suspenda completamente a pelota por tubulação leve. Centrifugar esta suspensão de pelotas a 7.000 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Descarte o supernatante, e mantenha a pelota, que contém as mitocôndrias brutas. Adicione 12 mililitros de 25% de gradiente de densidade para suspender re-suspender as mitocôndrias brutas extraídas. Faça um gradiente de densidade descontínua contendo as mitocôndrias brutas re-suspensas, conforme descrito no protocolo de texto, e centrífugue-o a 52.000 xg, e a quatro graus Celsius por 90 minutos.
Use uma seringa longa e contundente para coletar as mitocôndrias purificadas na interface entre os meios de 25% e 30% gradientes, e transfira isso para um tubo limpo. Adicione o tampão de isolamento mitocondrial às mitocôndrias coletadas para diluí-lo a um volume de três vezes. Centrifugar a 15.000 xg, e a quatro graus Celsius por 20 minutos.
Descarte o supernasce, e mantenha a pelota. Colete a última pelota que contém as mitocôndrias purificadas, e armazene-a a 20 graus Celsius. Primeiro, prepare 250 mililitros do tampão de isolamento mitocondrial, conforme descrito no protocolo de texto.
Adicione aproximadamente 1,5 gramas dos tecidos ovarianos de controle normal a uma xícara de vidro limpa. Adicione dois mililitros de tampão de isolamento mitocondrial pré-resfriado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido. Repita esta lavagem três vezes.
Usando uma tesoura oftálmica limpa, pique totalmente o tecido em pedaços que são aproximadamente 1 milímetro cúbico, e transfira os tecidos picados para um tubo limpo de 50 mililitros. Adicione oito mililitros de uma solução contendo 0,05% de trippsina e 20 mililitros EDTA e PBS aos tecidos de controle picados, e digerir à temperatura ambiente por 30 minutos para ajudar a lise as células e liberar as mitocôndrias. Centrífuga a 200 xg por cinco minutos.
Descarte o supernasce, e mantenha os tecidos e células. Adicione 13,5 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial contendo nagarse a uma concentração de 0,2 miligramas por mililitro, e use um homogeneizador elétrico para homogeneizar os tecidos picados a quatro graus Celsius por dois minutos. Adicione mais três mililitros de tampão de isolamento mitocondrial ao tecido homogeneiza e misture bem por pipetação.
Centrifugar o tecido preparado homogeneizar a 1.300 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos. Retire a pelota e mantenha o supernatante. Centrifugar o supernante a 10.000 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Remova o supernatante, que contém os microssósmos, e mantenha a pelota. Em seguida, adicione 2 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial e suspenda completamente a pelota por tubulação leve. Centrifugar esta suspensão de pelotas a 7.000 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Descarte o supernatante e mantenha a pelota que contém as mitocôndrias brutas. Adicione 12 mililitros de 25% de gradiente de densidade para suspender re-suspender as mitocôndrias brutas extraídas. Faça um gradiente de densidade descontínua contendo as mitocôndrias brutas como descrito no protocolo de texto, e centrifuá-lo a 52.000 xg e a quatro graus Celsius por 90 minutos.
Use uma seringa longa e contundente para coletar as mitocôndrias purificadas na faixa da interface entre os meios de 25 e 30% gradientes até a interface entre os meios de 34 e 38%. Transfira as mitocôndrias purificadas para um tubo limpo. Adicione o tampão de isolamento mitocondrial às mitocôndrias coletadas para diluí-lo a um volume de três vezes.
Centrifugar a 15.000 xg e a quatro graus Celsius por 20 minutos, e descartar o supernaspe. Adicione 2 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial para suspender novamente a pelota e a centrífuga a 15.000 xg e a quatro graus Celsius por 20 minutos. Descarte o supernatante e mantenha a pelota.
Pegue a última pelota e guarde-a a 20 graus Celsius. Neste estudo, amostras mitocondriais de alta qualidade são preparadas a partir do câncer de ovário humano e tecidos de controle para proteômica quantitativa em larga escala. Existem algumas diferenças na preparação das mitocôndrias a partir de tecidos de câncer de ovário e controlar tecidos ovarianos, incluindo o uso de um gradiente de densidade descontínua diferente.
Após a centrifugação, as mitocôndrias purificadas de tecidos de câncer de ovário são encontradas na interface entre 25% e 30%, enquanto as de tecidos ovarianos de controle são encontradas na faixa da interface entre 25% e 30% até a interface entre 34% e 38% A qualidade das mitocôndrias preparadas é então avaliada com centrifugação de velocidade diferencial e centrífuga de densidade através de microcóspia eletrônica. As imagens do microscópio eletrônico demonstram que, tanto no câncer de ovário quanto no controle dos tecidos ovarianos, as principais organelas isoladas são mitocôndrias, exceto por uma pequena quantidade de peroxisomes. No entanto, a morfologia das mitocôndrias é vista como uma mudança mais em cânceres de ovário do que controlar o tecido ovariano.
A qualidade das mitocôndrias preparadas também é avaliada via mancha ocidental. As imagens de manchas ocidentais também demonstram que o principal componente em amostras mitocondriais preparadas de cânceres de ovário e ovários de controle são mitocôndrias, exceto por uma pequena quantidade de peroxisomes, o que é consistente com a análise da microscopia eletrônica. É razoável que os peroxisomes sejam contidos nas mitocôndrias preparadas, pois as mitocôndrias interagem extensivamente com os peroxisomes, o que por sua vez reflete a completude funcional das mitocôndrias.
Esses resultados demonstram a alta qualidade das amostras mitocondriais preparadas. Quando estou realizando este procedimento, é muito importante que você pica totalmente tecidos antes da homogeneização, e adicione a trippsina aos tecidos de controle picados. Também é importante que você faça e ou prepare gradiente de densidade descontínua para as amostras de câncer e os controles.
Após este procedimento, a proteômica quantitativa iTRAQ ou TMT ou fosfoproteômica pode ser realizada para esclarecer o perfil mitocôndrias proteome do câncer de ovário, e o perfil fosfoproteome pode ser estabelecido para esclarecer os papéis das mitocôndrias no câncer de ovário em grandes profundidades. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores estudarem sistematicamente mitocôndrias proteome e o fosfoproteome no câncer de ovário, construir o sistema de rede de caminhos de sinalização e descobrir os biomarcadores confiáveis e os alvos terapêuticos.
