שינויים מיטוכונדריאליים לשחק תפקידים חשובים סרטן השחלות האנושי. פרוטוקול זה להקים פלטפורמה יעילה לבודד ולטהר מיטוכונדריה מסרטן השחלות האנושית ואת רקמות הבקרה לניתוח פרוטומיקה בקנה מידה גדול. מיטוכונדריה, כמו מרכזים של חילוף החומרים של האנרגיה, איתות תאים, ומתח חמצוני, תובנה לתוך שינויים פרוטאום המיטוכונדריאלי סרטן השחלות לטובת המנגנון המולקולרי ההבנה שלנו, והוא גילוי של סמנים ביולוגיים יעילים ואת המטרות הטיפוליות.
טכניקה זו משתמשת בצנטריפוגה במהירות דיפרנציאלית בשילוב עם צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות כדי להפריד את המיטוכונדריה מסרטן השחלות האנושי ברקמות הבקרה, ותוצאותיה דגימות מיטוכונדריה באיכות גבוהה לניתוח פרוטומיקה כמותית. הכנת המיטוכונדריה, יחד עם פרוטומיקה כמותית iTRAQ, שימשו בהצלחה בניתוח של רקמת סרטן השחלות האנושית, אשר מתרגמת בקלות לנתח רקמות אחרות, פרוטומיקה מיטוכונדריה. אלה שמעולם לא ביצעו שיטה זו עשויים לגלות כי זה יכול להיות קשה לבודד מיטוכונדריה משליטה בשחלות מאשר רקמות סרטן.
יש צורך להוסיף טריפסין כדי לשפר את הומוגניזציה רקמת הבקרה ולהוסיף שכבה נוספת של מדיום שיפוע צפיפות כדי לשפר את ההפרדה המיטוכונדריה. כדי להתחיל בהליך זה, הכן 250 מיליליטר של מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מניחים כ 1.5 גרם של רקמות סרטן השחלות בצלחת זכוכית נקייה.
הוסף שני מיליליטר של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי מקורר מראש כדי לשטוף קלות את הדם מפני השטח של הרקמה. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים. לאחר מכן, השתמש מספריים עיניים נקיים כדי לטחון את הרקמה באופן מלא לחתיכות כי הם כמילימטר מעוקב אחד, ולהעביר את הרקמות טחון לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.
הוסף 13.5 מיליליטר של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי המכיל nagarse בריכוז של 0.2 מיליגרם למיליליטר. השתמש homogenizer אלקטרונית כדי הומוגניזציה של רקמות טחון במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף עוד שלושה מיליליטר של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי לרקמות homogenates ומערבבים אותם היטב על ידי צינורות.
צנטריפוגה הרקמה המוכנה הומוגנית ב 1, 300 xg, וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את גלולה ולשמור על טבעי. לאחר מכן, צנטריפוגה supernatant ב 10, 000 xg וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הסר את המיקרוזום המכיל על-טבעי, ושמור את גלולה. הוסף 2 מיליליטר של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי מחדש להשעות את גלולה ביסודיות על ידי צינור אור. צנטריפוגה זה השעיית גלולה ב 7, 000 xg וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
השלך את העל-טבעי, ושמור את גלולת, המכילה את המיטוכונדריה הגולמית. הוסף 12 מיליליטר של 25% שיפוע בינוני כדי להשעות מחדש את המיטוכונדריה הגולמית שחולצו. בצע שיפוע צפיפות רציפה המכיל את המיטוכונדריה הגולמית המושעית מחדש כמתואר בפרוטוקול הטקסט, וצנטריפוג אותו ב 52, 000 xg, וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
השתמשו במזרק ארוך וקהה כדי לאסוף את המיטוכונדריה המטוהרת בממשק שבין מדיומים של 25% ל-30%, והעברו אותו לצינור נקי. הוסיפו חיץ בידוד מיטוכונדריאלי למיטוכונדריה שנאספה כדי לדלל אותה לנפח של פי שלושה. צנטריפוגה ב 15, 000 xg, וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
השלך את העל-טבעי, ושמור את גלולת הכדור. לאסוף את גלולה הסופית המכילה את המיטוכונדריה מטוהרים, ולאחסן אותו ב 20 מעלות צלזיוס. ראשית, הכינו 250 מיליליטר של מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
מוסיפים כ-1.5 גרם מרקמות השחלות הרגילות לצלחת זכוכית נקייה. הוסף שני מיליליטר של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי מקורר מראש כדי לשטוף קלות את הדם מפני השטח של הרקמה. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים.
באמצעות מספריים עיניים נקיים, טחון מלא את הרקמה לחתיכות כי הם כ 1 מילימטר מעוקב, ולהעביר את הרקמות טחון לתוך צינור נקי 50 מיליליטר. הוסף שמונה מיליליטר של פתרון המכיל 0.05% טריפסין ו 20 מילימולר EDTA ו PBS לרקמות הבקרה טחון, ולעכל בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי לעזור ללתות את התאים ולשחרר את המיטוכונדריה. צנטריפוגה ב 200 xg במשך חמש דקות.
השלך את העל-טבעי, ושמור על הרקמות והתאים. הוסף 13.5 מיליליטר של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי המכיל nagarse בריכוז של 0.2 מיליגרם למיליליטר, ולהשתמש homogenizer חשמלי כדי הומוגניזציה של רקמות טחון בארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. מוסיפים עוד שלושה מיליליטר של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי לרקמות הומוגנטיות ומערבבים ביסודיות על ידי צינורות.
צנטריפוגה הרקמה המוכנה הומוגנית ב 1, 300 xg וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את גלולה ולשמור על טבעי. צנטריפוגה supernatant ב 10, 000 xg וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הסר את supernatant, אשר מכיל את המיקרוזמים, ולשמור את גלולה. לאחר מכן, להוסיף 2 מיליליטר של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי מחדש להשעות את גלולה ביסודיות על ידי צינור אור. צנטריפוגה זה השעיית גלולה ב 7, 000 xg וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
השלך את העל-טבעי ושמור את גלולת המכילה את המיטוכונדריה הגולמית. הוסף 12 מיליליטר של 25% שיפוע בינוני כדי להשעות מחדש את המיטוכונדריה הגולמית שחולצו. הפוך שיפוע צפיפות רציפה המכיל את המיטוכונדריה הגולמית כמתואר בפרוטוקול הטקסט, וצנטריפוגה אותו ב 52, 000 xg וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
השתמש במזרק ארוך וקהה כדי לאסוף את המיטוכונדריה המטוהרת בטווח שבין מדיומים 25 ו 30%gradient לממשק בין מדיומים 34 ו 38%gradient. מעבירים את המיטוכונדריה המטוהרת לצינור נקי. הוסיפו חיץ בידוד מיטוכונדריאלי למיטוכונדריה שנאספה כדי לדלל אותה לנפח של פי שלושה.
צנטריפוגה ב 15, 000 xg וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולהשליך את העל טבעי. הוסף 2 מיליליטר של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי כדי להשעות מחדש את גלולה וצנטריפוגה ב 15, 000 xg וב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. השלך את העל-טבעי ושמור את גלולת הכדור.
לאסוף את גלולה הסופית ולאחסן אותו ב 20 מעלות צלזיוס. במחקר זה, דגימות מיטוכונדריות באיכות גבוהה מוכנות מסרטן השחלות האנושי ורקמות בקרה עבור פרוטומיקה כמותית בקנה מידה גדול. ישנם כמה הבדלים בהכנת המיטוכונדריה מרקמות סרטן השחלות ורקמות השחלות שליטה, כולל באמצעות שיפוע צפיפות רציפה שונה.
לאחר צנטריפוגה, המיטוכונדריה מטוהרים מרקמות סרטן השחלות נמצאים בממשק בין 25% ל 30%בעוד אלה מרקמות השחלות שליטה נמצאים בטווח מן הממשק בין 25%- ו-30% לממשק שבין 34% ל-38% איכות המיטוכונדריה המוכנה מוערכת לאחר מכן באמצעות צנטריפוגה של מהירות דיפרנציאלית וצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים מראות כי הן סרטן השחלות והן רקמות השחלות שליטה, organelles העיקריים מבודדים הם מיטוכונדריה, למעט כמות קטנה של peroxisomes. עם זאת, המורפולוגיה של המיטוכונדריה נתפסת לשנות יותר סרטן השחלות מאשר לשלוט רקמת השחלות.
איכות המיטוכונדריה המוכנה מוערכת גם באמצעות כתם מערבי. התמונות הכתימות המערביות גם מראות כי המרכיב העיקרי בדגימות מיטוכונדריות מוכנות מסרטן השחלות ושחלות הבקרה הוא המיטוכונדריה, למעט כמות קטנה של פרוקסימוזום, אשר עולה בקנה אחד עם ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים. זה סביר peroxisomes להיות כלול המיטוכונדריה מוכן, כי המיטוכונדריה אינטראקציה נרחבת עם peroxisomes, אשר בתורו משקף את השלמות הפונקציונלית של המיטוכונדריה.
תוצאות אלו ממחישות את האיכות הגבוהה של דגימות המיטוכונדריה המוכנות. כשאני מבצע את ההליך הזה, חשוב מאוד שתטמין רקמות באופן מלא לפני ההומוגניזציה, ותוסיף את ה טריפסין לרקמות הבקרה הטחון. חשוב גם כי אתה עושה או מוכן שיפוע צפיפות רציפה עבור דגימות סרטן ואת הפקדים.
בעקבות הליך זה, iTRAQ או פרוטומיקה כמותית TMT או phosphoproteomics ניתן לבצע כדי להבהיר סרטן השחלות פרופיל פרוטאום מיטוכונדריה, פרופיל phosphoproteome ניתן ליצור כדי להבהיר את התפקידים של מיטוכונדריה בסרטן השחלות בעומקים גדולים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור באופן שיטתי את המיטוכונדריה פרוטאום ואת הפוספופרוטומה בסרטן השחלות, לבנות את מערכת רשת מסלול האיתות, ולגלות את סמנים ביולוגיים אמינים ואת המטרות הטיפוליות.
