Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la importancia de la dinámica de expresión génica en la proliferación y diferenciación celular, particularmente la dinámica de las moléculas de señalización de Muesca en las células madre neurales. La principal ventaja de esta técnica es que podemos monitorizar la expresión génica tanto in vitro como in vivo con una precisión muy alta mediante imágenes en vivo. Demostrando el procedimiento estará Hiromi Shimojo, el profesor asistente de mi laboratorio que desarrolló esta nueva tecnología.
Para la introducción de Dll1 F luciferase en NPC, confirme una falta de respuesta al reflejo del pedal en un día embrionario de 12,5 a 14,5 ratón embarazada antes de hacer una incisión de dos a tres centímetros a través del abdomen, a lo largo de la línea media. Coloque la gasa empapada de PBS alrededor de la incisión y use fórceps en forma de anillo para extraer cuidadosamente el cuerno uterino correcto. Después de contar los embriones, utilice un micro capilar para inyectar de uno a dos microlitros de ADN mixto de reportero de Luciferase Dll1 F en el ventrículo del telencéfalo de cada embrión.
Una inyección exitosa resultará en la observación de tinte azul sobre la superficie del útero. Para la electroporación, humedezca el útero y el electrodo con PBS, y agarre suavemente la cabeza del primer embrión. Establezca el electrodo cargado positivamente en el lado del hemisferio en el que se inyectó el ADN, y proporcione cinco pulsos de 30 a 50 voltios y 50 milisegundos, con una pausa de un segundo entre pulsos, comprobando que las burbujas se generan a partir del electrodo cargado negativamente.
Cuando se hayan inyectado todos los embriones, devuelva el cuerno uterino izquierdo al abdomen y utilice una aguja de 17 milímetros para cerrar la incisión con una sutura de seda 4-0, colocando PBS caliente en la cavidad abdominal antes de completar el cierre. Para establecer un cultivo de PNJ disociado, primero coloque el útero de un día embrionario 12.5 a 14.5 embarazada Dll1 ubiquitinado ratón luciferasa en un plato petri de 10 centímetros que contiene 25 mililitros de PBS helada, y utilizar micro tijeras y fuerzas finas para eliminar los embriones del útero. Después de decapitar los embriones, coloque las cabezas en un nuevo plato de Petri de 10 centímetros que contenga DMEM/F12 helado, y retire la epidermis y el cartílago que rodea cada cerebro.
Transfiera los cerebros a un plato de 35 milímetros bajo un microscopio diseccionado que contenga tres mililitros de medio N2B27 helado. Retire el telencéfalo derecho e izquierdo del diencéfalo. Utilice fórceps finos para eliminar los meninges que cubren la superficie del telencéfalo y para diseccionar la parte dorsolateral de la corteza del telencéfalo.
Cuando todos los tejidos neurales de interés hayan sido aislados, utilice una pipeta P1000 para transferir las muestras a tubos individuales de 1,5 mililitros, y utilice una pipeta P200 para aspirar cualquier medio adicional de cada tubo. Añadir 100 microlitros de solución de papaína por par de corteza, y colocar las muestras a 24 grados Celsius durante 15 minutos. Al final de la incubación, pipetee suavemente las muestras 10 veces con una nueva pipeta P1000, y devuelva los tubos a 24 grados centígrados durante 15 minutos adicionales.
Al final de la incubación, pipetee suavemente las muestras de nuevo antes de recoger los tejidos digeridos por centrifugación. Aspirar los sobrenadantes y resuspender suavemente cada pellet con un mililitro de medio DMEM/F12. Centrifugar las muestras tres veces más como se acaba de demostrar, resuspendiendo suavemente cada pellet con un nuevo mililitro de medio después de cada centrifugación.
Después de la última centrifugación, resuspender los pellets en 500 microlitros de N2B27 medio complementado con luciferina de unlitrolar, y sembrar una vez 10 a las seis células de cada muestra en platos individuales de fondo de vidrio recubierto de poli-L-lisina. A continuación, coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante una hora. Una vez que las células se hayan adherido al plato, añadir dos mililitros de N2B27 medio fresco más luciferina de un milimolar a cada plato.
Para visualizar la expresión del reportero de luciferasa en cultivos de disociación npC, seleccione el objetivo de inmersión en aceite y coloque el plato de muestra en la etapa del microscopio. Vea el campo manualmente para determinar la mejor posición para ver las celdas y concéntrese en las celdas de interés. Haga clic en Live para adquirir la imagen de prueba y utilice el programa Adquisición multidimensional para ejecutar la adquisición de lapso de tiempo por luminiscencia bidimensional y adquisiciones de campo brillante durante 24 horas.
Para preparar el desarrollo de cultivos de rebanadas de corteza, un día después de la inyección del reportero, cosechar el día embrionario 13.5 a 14.5 cerebros embrionarios como se ha demostrado, y colocar el plato que contiene los cerebros en la etapa de un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Confirme que cada corteza expresa al reportero fluorescente inyectado bajo la luz de excitación adecuada, y transfiera los cerebros a una tabla de corte de goma de silicona llena de 30 mililitros de medio DMEM/F12, burbujeado con gas 100% oxígeno. Utilice un cuchillo microquirúrgico y fórceps finos para cortar el borde entre la porción medial y lateral del telencéfalo dorsal, y separar el tejido en dos hemisferios.
Luego, usa el cuchillo para cortar la corteza como rayas para obtener rodajas corticales, transfiriendo las rodajas en el medio de la tabla de cortar a una nueva placa Petri de 35 milímetros a medida que se adquieren. Una vez recogidas todas las rodajas, coloque la superficie cortada de cada rebanada en un inserto de cultivo en un plato inferior de vidrio que contenga un medio enriquecido, ajustando la orientación de cada rebanada con fórceps finos según sea necesario. A continuación, retire cualquier exceso de medio con una pipeta y coloque el plato en una incubadora multigás establecida en 40% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Al final de la incubación, añadir 300 microlitros de medio enriquecido complementado con luciferina de unlitrolar al plato de cultivo. Para visualizar la expresión del reportero de luciferasa dentro de las culturas de la rebanada, seleccione el objetivo 40x y coloque el plato de muestra en la etapa del microscopio. Adquirir una imagen de prueba de la fluorescencia, y establecer la posición y el plano de enfoque a la región de interés bajo la iluminación de la luz de excitación adecuada.
A continuación, ejecute la adquisición de lapso de tiempo mediante luminiscencia tridimensional, fluorescencia y adquisiciones de campo brillante durante 24 horas. Para monitorear la actividad promotora del gen oscilante Dll1, se puede utilizar luciferasa ubiquitinada, un reportero de luciferasa desestabilizado con una vida media de unos 10 minutos. Al igual que un reportero fluorescente, el reportero de luciferasa se puede utilizar para monitorear la dinámica de expresión de una proteína al fusionarse con la secuencia de codificación genética de interés.
Para visualizar la expresión de los reporteros a nivel de una sola célula en los cultivos de tejidos, el gen reportero puede ser trans infectado transitoriamente en PNJ a través de la electroporación del útero como se ha demostrado. Además, las imágenes basadas en microscopios permiten la adquisición de imágenes de campo brillante, fluorescencia y quimiuminescencia. El reportero de la actividad promotora de Dll1 exhibe una expresión oscilatoria en los PNJ derivada del telencéfalo de los ratones reportero de F luciferasa ubiquitinados de Dll1, con el reportero de luciferasa desestabilizado indicando una fuerte regulación hacia arriba y hacia abajo de la expresión de la actividad promotora.
En las células positivas de proteína fluorescente verde mejoradas adyacentes que llevan a Hes1 reportero y mCherry-positivo reportero de proteínas que expresaron Dll1 reportero de proteínas que se puso en contacto entre sí durante la observación, la expresión del reportero de Hes1 parece comenzar unos 60 minutos después del contacto, lo que sugiere que el retraso de tiempo para la transmisión de la señalización de Notch entre las células adyacentes es de aproximadamente una hora. Además, durante la transmisión de la señal, la expresión proteica Dll1 exhibe una translocación dinámica. Al adquirir la imagen de bioluminiscencia, mantenga la sala del microscopio completamente oscura, ya que la luz ajena puede impedir una adquisición óptima.
Los recientes desarrollos en optogenética nos permiten controlar la expresión génica con luz. Con esta técnica, podemos introducir simultáneamente varios patrones de expresión génica y monitorear las respuestas de los reporteros de luciferasa.
