이 방법은 세포 증식 및 분화에서 유전자 발현 역학의 중요성, 특히 신경 줄기 세포에서 노치 신호 분자의 역학에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 살아있는 화상 진찰에 의하여 아주 높은 정밀도로 시험관 내 및 생체 내 둘 다 유전자 발현을 감시할 수 있다는 것입니다. 이 새로운 기술을 개발한 실험실의 조교수 인 시모조 히로미(Hiromi Shimojo)가 절차를 시연할 것입니다.
Dll1 F luciferase 기자 소개NPC에 대 한, 배아 날에 페달 반사에 응답의 부족을 확인 12.5 받는 사람 14.5 임신 마우스 를 통해 2-3 센티미터 절개를 하기 전에, 중간 라인을 따라. PBS에 흠뻑 젖은 거즈를 절개 주위에 놓고 링 모양의 집게를 사용하여 오른쪽 자궁 경적을 조심스럽게 추출합니다. 배아를 계산한 후, 마이크로 모세관을 사용하여 혼합 Dll1 F 루시파라제 기자 DNA의 1~2개의 마이크로리터를 각 배아의 텔렌세팔론 심실에 주입한다.
성공적인 주사는 자궁 의 표면에 파란 염료의 준수 귀착될 것입니다. 전기화의 경우, 자궁과 전극을 PBS로 적시고 첫 번째 배아의 머리를 부드럽게 잡습니다. DNA가 주입된 반구의 측면에 양전하 전극을 설정하고, 펄스 사이에 1초 동안 일시 정지하여 5개의 30-50볼트, 50밀리초 펄스를 제공하여 음전하 전극에서 거품이 생성되는지 확인합니다.
모든 배아가 주입되면 왼쪽 자궁 경적을 복부에 반환하고 17mm 바늘을 사용하여 4-0 실크 봉합사로 절개를 닫고 폐쇄를 완료하기 전에 복강에 따뜻한 PBS를 배치합니다. 해리된 NPC 배양을 설정하려면, 먼저 배아일 12.5에서 14.5 임신 Dll1 유비쿼터트 루시포제 형 균질 마우스를 얼음 차가운 PBS의 25 밀리리터를 포함하는 10 센티미터 페트리 접시에 넣고 마이크로 가위및 미세 한 힘을 사용하여 배아로부터 배아를 제거합니다. 배아를 참수한 후, 얼음 차가운 DMEM/F12를 포함하는 새로운 10센티미터 페트리 접시에 머리를 놓고 각 뇌를 둘러싼 표피와 연골을 제거합니다.
얼음 차가운 N2B27 배지의 3 밀리리터를 포함하는 해부 현미경의 밑에 35 밀리미터 접시로 두뇌를 전송합니다. 디엔셀론에서 오른쪽 및 왼쪽 텔렌실론을 제거합니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 텔렌스팔론의 표면을 덮고 수막을 제거 하 고 텔 렌 스 펠 론에서 피 질의 등 측 부분을 해부.
관심있는 신경 조직의 모든 격리 된 경우, 개별 1.5 밀리리터 튜브로 샘플을 전송P1000 파이펫을 사용하고, 각 튜브에서 여분의 매체를 흡인P200 파이펫을 사용합니다. 피질 쌍당 100 마이크로리터의 파아플 용액을 추가하고 샘플을 섭씨 24도에서 15분 동안 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 새로운 P1000 파이펫으로 샘플을 10번 부드럽게 피펫하고 튜브를 섭씨 24도로 추가로 15분 간 반환합니다.
인큐베이션의 끝에서 원심 분리에 의해 소화된 조직을 수집하기 전에 샘플을 부드럽게 피펫합니다. 수퍼넌트들을 흡인시키고, DMEM/F12 배지 1밀리리터로 각 펠릿을 부드럽게 재분리합니다. 원심분리는 시료를 단지 시연한 대로 3배 더, 각 환원 분리 후 신선한 밀리리터로 부드럽게 재연합니다.
마지막 원심 분리 후, 1 밀리머 루시페린으로 보충된 N2B27 배지의 500 마이크로리터에서 펠릿을 재보중단하고, 각 샘플에서 6개의 세포로 10번 시드를 개별 폴리 L-L-리신 코팅 유리 바닥 접시에 뿌린다. 그런 다음, 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다. 세포가 접시에 부착되면, 신선한 N2B27 배지의 두 밀리리터플러스 각 접시에 1 밀리머 루시피린을 추가합니다.
NPC 해리 배양에서 루시파라제 기자 발현을 시각화하려면 오일 침지 목표를 선택하고 샘플 접시를 현미경 단계에 배치합니다. 필드를 수동으로 보고 셀을 볼 수 있는 최상의 위치를 결정하고 관심 있는 셀에 집중합니다. 라이브를 클릭하여 테스트 이미지를 획득하고 다차원 획득 프로그램을 사용하여 2차원 발광 및 밝은 필드 획득을 통해 2차원 발광 및 밝은 필드 획득을 24시간 동안 실행합니다.
피질 슬라이스 배양 개발을 준비하기 위해, 기자 주사 후 하루, 배아 일 13.5 받는 사람 14.5 배아 뇌를 수확하여, 형광 입체 현미경의 단계에 뇌를 함유 한 접시를 놓는다. 각 피질이 적절한 흥분 광 하에서 주입 된 형광 기자를 표현하고 뇌를 DMEM / F12 배지30 밀리리터로 채워진 실리콘 고무 도마로 옮기고 100 % 산소 가스로 거품을 낸지 확인하십시오. 마이크로 수술 칼과 미세 집게를 사용하여 등간 텔뇌스팔론의 내측과 측면 부분 사이의 경계를 절단하고 조직을 두 반구로 분리하십시오.
그런 다음 칼을 사용하여 줄무늬와 같은 피질을 자르고 피질 조각을 얻고, 도마에서 중간 크기의 슬라이스를 새로운 35mm 페트리 접시로 옮기는 것입니다. 모든 슬라이스가 수집되면 각 슬라이스의 절단 표면을 농축 된 매체가 들어있는 유리 바닥 접시에 세팅 된 배양 인서치에 놓고 필요에 따라 각 슬라이스의 방향을 미세 한 집게로 조정합니다. 그런 다음 파이펫으로 초과 매체를 제거하고 접시를 40% 산소, 5%이산화탄소, 섭씨 37도로 설정된 다중 가스 인큐베이터에 30분 동안 배치합니다.
인큐베이션이 끝나면 300마이크로리터의 농축 된 매체를 문화 요리에 1 밀리머 루시피린으로 보충합니다. 슬라이스 배양 내에서 루시파라제 기자 발현을 시각화하려면 40배 목표를 선택하고 샘플 접시를 현미경 단계에 배치한다. 형광의 시험 영상을 획득하고, 적절한 흥분광의 조명 아래 관심 영역으로 위치 및 초점 평면을 설정합니다.
그런 다음 24시간 동안 3차원 발광, 형광 및 밝은 필드 인수를 통해 시간 경과 획득을 실행합니다. 진동 유전자 Dll1의 프로모터 활성을 모니터링하기 위해, 약 10분의 반감기를 가진 불안정한 루시파라제 기자인 유비퀴티드 루시파라제(luciferase)를 사용할 수 있다. 형광 기자처럼, 루시파라제 리포터는 관심의 유전자 코딩 서열에 융합됨으로써 단백질의 발현 역학을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
조직 배양에서 단세포 수준에서 기자 발현을 시각화하기 위해, 리포터 유전자는 입증된 바와 같이 자궁 전기기화를 통해 NPC로 일시적으로 전환될 수 있다. 또한 현미경 기반 이미징을 통해 밝은 분야, 형광 및 화학 발광 이미지를 습득할 수 있습니다. Dll1 프로모터 활동의 리포터는 Dll1 유비퀴티드 F 루시프라아제 기자 마우스의 텔렌세팔론에서 파생된 NPC에서 진동표현을 나타내며, 불안정한 루시프라아제 리포터는 프로모터 활동의 발현에 대한 급격한 상하 조절을 나타낸다.
관찰 과정에서 서로 접촉한 Dll1 단백질 리포터를 발현하는 Hes1 기자 및 mCherry 양성 세포를 운반하는 인접한 향상된 녹색 형광 단백질 양성 세포에서 Hes1 기자 발현은 접촉 후 약 60분 후에 시작되는 것으로 보이며, 인접한 세포 들 간의 노치 시그널링 전송시시간 지연이 약 1시간임을 시사한다. 더욱이, 신호 전송 도중, Dll1 단백질 발현은 동적 전좌를 나타낸다. 생물 발광 이미징을 습득 할 때, 외부 빛이 최적의 획득을 방지 할 수 있기 때문에 현미경 실을 완전히 어둡게 유지하십시오.
광유전학에 있는 최근 발달은 우리가 빛으로 유전자 발현을 통제할 수 있습니다. 이 기술을 통해 다양한 유전자 발현 패턴을 동시에 도입하고 루시파라제 리포터 반응을 모니터링할 수 있습니다.
