Bu yöntem, hücre çoğalması ve farklılaşmasında gen ekspresyonu dinamiğinin önemi, özellikle nöral kök hücrelerdeki Çentik sinyal moleküllerinin dinamikleri hakkında anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, canlı görüntüleme ile hem in vitro hem de in vivo gen ekspresyonunu çok yüksek hassasiyetle izleyebiliyor olmamızdır. Prosedürü gösteren Hiromi Shimojo, bu yeni teknolojiyi geliştiren laboratuvarımdaki yardımcı doçent.
Dll1 F luciferase muhabirinin NPC'ye girişi için, 12,5 ila 14,5 gebe farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğrulayın ve karın dan iki ila üç santimetrelik bir kesi yaparak orta hat boyunca ilerleyin. Kesinin etrafına PBS'li gazlı bez yerleştirin ve doğru rahim boynuzunu dikkatlice çıkarmak için halka şeklinde ki forceps'leri kullanın. Embriyoları sayarak sonra, her embriyonun vensefalisine bir ila iki mikrolitre karışık Dll1 F luciferase muhabiri DNA enjekte etmek için bir mikro kılcal damar kullanın.
Başarılı bir enjeksiyon rahim yüzeyi üzerinde mavi boya gözlemneden olacaktır. Elektroporasyon için, PBS ile rahim ve elektrot ıslak ve yavaşça ilk embriyo başkanı kavramak. Pozitif yüklü elektrodu DNA'nın enjekte edildiği yarımkürenin yan tarafına ayarlayın ve darbeler arasında bir saniyelik bir duraklama ile beş adet 30 ila 50 volt, 50 milisaniyelik darbeler sağlayın, negatif yüklü elektrottan kabarcıklar üretildiğini kontrol edin.
Tüm embriyolar enjekte edildiğinde, sol rahim boynuzu karın dönmek, ve 4-0 ipek sütür ile kesi kapatmak için 17 milimetrelik bir iğne kullanın, kapatma tamamlamadan önce karın boşluğuna sıcak PBS yerleştirerek. Ayrışmış bir NPC kültürü kurmak için, ilk embriyonik gün 12,5 ila 14,5 hamile Dll1 her yerde luciferase transgenik fare bir 10 santimetre Petri çanak buz-soğuk PBS 25 mililitre içeren içine rahim yer ve rahim embriyoları kaldırmak için mikro makas ve ince çerkedikler kullanın. Embriyoların kafasını kestikten sonra, kafaları buz gibi DMEM/F12 içeren 10 santimetrelik yeni bir Petri kabına yerleştirin ve her beyni çevreleyen epidermisin ve kıkırdağı çıkarın.
Beyinleri, üç mililitre buz gibi N2B27 ortamı içeren bir kesme mikroskobu altında 35 milimetrelik bir tabağa aktarın. Diensefalon sağ ve sol telencephalon çıkarın. Telensefalon yüzeyini kaplayan menenjleri çıkarmak ve telensefalondan korteksin dorsolateral kısmını incelemek için ince çerkeciler kullanın.
İlgi çeken tüm sinir dokuları izole edildiğinde, numuneleri tek tek 1,5 mililitrelik tüplere aktarmak için p1000 pipeti kullanın ve her tüpten herhangi bir ekstra ortam aspire etmek için bir P200 pipeti kullanın. Korteks çifti başına 100 mikrolitre papain çözeltisi ekleyin ve numuneleri 15 dakika boyunca 24 derecede yerleştirin. Kuluçka sonunda, numuneleri yeni bir P1000 pipetle 10 kez pipetleyin ve tüpleri 15 dakika daha 24 santigrat dereceye geri verin.
Kuluçka sonunda, sindirilmiş dokuları santrifüj le toplamadan önce numuneleri hafifçe pipetleyin. Süpernatantları aspire edin ve her peleti bir mililitre DMEM/F12 ortamıyla hafifçe askıya alın. Numuneleri sadece gösterildiği gibi üç kez daha santrifüj edin, her bir santrifüjden sonra her peleti taze bir mililitre orta ile hafifçe yeniden sulandırın.
Son santrifüjden sonra, tek milimolar luciferin ile desteklenen 500 mikrolitre N2B27 orta peletleri yeniden askıya alın ve her örnekten altı hücreye bir kez 10 kez poli-L-lizin kaplı cam alt tabaklara tohum. Daha sonra, bir saat hücre kültürü kuluçka plakaları yerleştirin. Hücreler yemeğe yapışıp kaldıktan sonra, her tabağa iki mililitre taze N2B27 orta artı bir milimolar luciferin ekleyin.
NPC dissosyasyon kültürlerinde luciferase muhabiri ifadesini görselleştirmek için, yağ daldırma hedefini seçin ve örnek kabı mikroskop aşamasına yerleştirin. Hücreleri görüntülemek için en iyi konumu belirlemek ve ilgi çeken hücrelere odaklanmak için alanı el ile görüntüleyin. Test görüntüsünü elde etmek için Canlı'yı tıklatın ve iki boyutlu parlaklık ve parlak alan edinimi ile 24 saat boyunca hızlandırılmış edinimini çalıştırmak için Çok Boyutlu Edinme programını kullanın.
Gelişen korteks dilimi kültürlerini hazırlamak için, muhabir enjeksiyonundan bir gün sonra, embriyonik gün 13.5-14.5 embriyo beyinlerini toplayın ve beyiniçeren kabı floresan stereoskopik mikroskobun sahnesine yerleştirin. Her korteksin enjekte edilen floresan muhabiri uygun uyarma ışığı altında ifade ettiğini doğrulayın ve beyni %100 oksijen gazıyla şişirilmiş 30 mililitre DMEM/F12 ortamıyla dolu silikon kauçuk kesme tahtasına aktarın. Dorsal telencephalon medial ve lateral kısmı arasındaki sınırı kesmek için bir mikro cerrahi bıçak ve ince çalgılar kullanın, ve iki yarımküreye doku ayırmak.
Daha sonra, kortikal dilimler elde etmek için korteks gibi korteks kesmek için bıçak kullanın, onlar elde edilir gibi yeni bir 35 milimetrelik Petri çanak içine kesme tahtası orta dilimleri aktarAn. Tüm dilimler toplandığında, her dilimin kesme yüzeyini zenginleştirilmiş ortam içeren cam bir alt tabağa yerleştirerek her dilimin yönünü gerektiği gibi ince çaksiliklerle ayarlayın. Daha sonra, bir pipet ile herhangi bir aşırı orta çıkarın ve 30 dakika boyunca% 40 oksijen, % 5 karbondioksit ve 37 derece santigrat ayarlanmış bir çok gaz lı kuluçka içine çanak yerleştirin.
Kuluçka sonunda, kültür çanak bir milimolar luciferin ile desteklenen zenginleştirilmiş orta 300 mikrolitre ekleyin. Dilim kültürleri içindeki luciferase muhabiri ifadesini görselleştirmek için 40x hedefini seçin ve örnek kabı mikroskop aşamasına yerleştirin. Floresan bir test görüntüsü elde edin ve uygun uyarma ışığının aydınlatılması altında konumu ve odak düzlemini ilgi bölgesine ayarlayın.
Ardından, üç boyutlu parlaklık, floresan ve parlak alan edinimi ile 24 saat boyunca hızlandırılmış edinimçalıştırın. Salınımlı gen Dll1'in promotör aktivitesini izlemek için, yaklaşık 10 dakikalık yarı ömrü olan dengesiz bir luciferase muhabiri olan her yerde bulunan luciferase kullanılabilir. Floresan bir muhabir gibi, luciferase muhabiri ilgi gen kodlama dizisine erimiş olarak bir proteinin ifade dinamiklerini izlemek için kullanılabilir.
Doku kültürlerinde tek hücreli düzeyde muhabir ifadesini görselleştirmek için, muhabir geni gösterildiği gibi rahim elektroporasyonu yoluyla np'lere geçici olarak geçirilebilir. Buna ek olarak, mikroskop tabanlı görüntüleme parlak alan, floresan ve kemilüminesans görüntülerinin elde edilmesini sağlar. Dll1 organizatör faaliyet muhabiri NPCs dll1 her yerde F luciferase muhabir farelerin telencephalon türetilen bir salınımifade sergiler, kararsız luciferase muhabiri organizatör faaliyetinin ifade keskin bir yukarı ve aşağı düzenleme gösteren ile.
Hes1 muhabiri ve gözlem sırasında birbirleriyle temas eden Dll1 protein muhabirini ifade eden mCherry pozitif hücreleri taşıyan bitişik geliştirilmiş yeşil floresan protein pozitif hücrelerde, Hes1 muhabirinin ifadesi temastan yaklaşık 60 dakika sonra başlar ve bitişik hücreler arasında Çentik sinyalinin iletimi için gecikmenin yaklaşık bir saat olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, sinyal iletimi sırasında, Dll1 protein ekspresyonu dinamik bir translokasyon sergiler. Biyolüminesans görüntülemesini elde ederken, mikroskop odasını tamamen karanlık tutun, çünkü yabancı ışık optimum bir edinimi önleyebilir.
Optogenetikteki son gelişmeler gen ekspresyonunu ışıkla kontrol etmemizi sağlar. Bu teknikle, aynı anda gen ekspresyonunun çeşitli modelini tanıtabilir ve luciferase muhabirinin tepkilerini izleyebiliriz.
