Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o significado da dinâmica da expressão genética na proliferação e diferenciação celular, particularmente a dinâmica das moléculas de sinalização notch em células-tronco neurais. A principal vantagem dessa técnica é que podemos monitorar a expressão genética tanto in vitro quanto in vivo com uma precisão muito alta por imagem ao vivo. Demonstrando o procedimento estará Hiromi Shimojo, professora assistente do meu laboratório que desenvolveu essa nova tecnologia.
Para a introdução do repórter de luciferase Dll1 F no NPC, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal em um dia embrionário de 12,5 a 14,5 camundongos grávidas antes de fazer uma incisão de dois a três centímetros através do abdômen, ao longo da linha média. Coloque gaze encharcada de PBS ao redor da incisão e use fórceps em forma de anel para extrair cuidadosamente o chifre uterino direito. Depois de contar os embriões, use um micro capilar para injetar um a dois microliters de DNA misto de repórter de luciferase Dll1 F no ventrículo do telencephalon de cada embrião.
Uma injeção bem sucedida resultará na observância do corante azul sobre a superfície do útero. Para eletroporação, molhe o útero e o eletrodo com PBS, e segure suavemente a cabeça do primeiro embrião. Defina o eletrodo carregado positivamente ao lado do hemisfério em que o DNA foi injetado, e forneça cinco pulsos de 30 a 50 volts, 50 milissegundos, com uma pausa de um segundo entre os pulsos, verificando se as bolhas são geradas a partir do eletrodo carregado negativamente.
Quando todos os embriões forem injetados, devolva o chifre uterino esquerdo ao abdômen, e use uma agulha de 17 milímetros para fechar a incisão com uma sutura de seda 4-0, colocando PBS quente na cavidade abdominal antes de completar o fechamento. Para criar uma cultura de NPC dissociada, primeiro coloque o útero de um dia embrionário de 12,5 a 14,5 camundongos transgênicos ubiquitinados Dll1 gestantes em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo 25 mililitros de PBS gelado, e use micro tesouras e fórceps finos para remover os embriões do útero. Depois de decapitar os embriões, coloque as cabeças em uma nova placa de Petri de 10 centímetros contendo DMEM/F12 gelado, e remova a epiderme e cartilagem ao redor de cada cérebro.
Transfira os cérebros para uma antena de 35 milímetros sob um microscópio dissecando contendo três mililitros de meio N2B27 gelado. Remova o telencephalon direito e esquerdo do diencephalon. Use fórceps finos para remover as meninges que cobrem a superfície do telencephalon e para dissecar a parte dorsolateral do córtex do telencephalon.
Quando todos os tecidos neurais de interesse tiverem sido isolados, use uma pipeta P1000 para transferir as amostras para tubos individuais de 1,5 mililitro, e use uma pipeta P200 para aspirar qualquer meio extra de cada tubo. Adicione 100 microliters de solução de papain por par de córtex, e coloque as amostras a 24 graus Celsius por 15 minutos. No final da incubação, pipeta suavemente as amostras 10 vezes com uma nova pipeta P1000, e devolva os tubos a 24 graus Celsius por mais 15 minutos.
No final da incubação, pipeta suavemente as amostras novamente antes de coletar os tecidos digeridos por centrifugação. Aspire os supernantes e resuspenque suavemente cada pelota com um mililitro de meio DMEM/F12. Centrifugar as amostras mais três vezes como apenas demonstrado, reutilizando suavemente cada pelota com um mililitro fresco de médio após cada centrifugação.
Após a última centrifugação, resuspenque as pelotas em 500 microliters de meio N2B27 suplementados com luciferina de um mililitro, e sementes uma vez 10 para as seis células de cada amostra em pratos individuais de fundo de vidro revestidos de poli-L-lysina. Em seguida, coloque as placas na incubadora de cultura celular por uma hora. Uma vez que as células tenham aderido ao prato, adicione dois mililitros de médio N2B27 fresco mais luciferina de um mililitro em cada placa.
Para visualizar a expressão do repórter luciferase nas culturas de dissociação do NPC, selecione o objetivo de imersão do óleo e coloque o prato de amostra no estágio do microscópio. Consulte o campo manualmente para determinar a melhor posição para visualizar as células e concentre-se nas células de interesse. Clique em Live para adquirir a imagem de teste e use o programa de aquisição multidimensional para executar a aquisição de lapso de tempo por luminescência bidimensional e aquisições de campo brilhante por 24 horas.
Para preparar o desenvolvimento de culturas de cortex, um dia após a injeção do repórter, colher o dia embrionário de 13,5 a 14,5 cérebros de embrião como demonstrado, e colocar o prato contendo o cérebro no palco de um microscópio estereoscópico fluorescence. Confirme que cada córtex expressa o repórter fluorescente injetado sob a luz de excitação apropriada, e transfira os cérebros para uma placa de corte de borracha de silicone preenchida com 30 mililitros de meio DMEM/F12, borbulhado com 100% de gás oxigênio. Use uma micro faca cirúrgica e fórceps finos para cortar a borda entre a porção medial e lateral do telencephalon dorsal, e separar o tecido em dois hemisférios.
Em seguida, use a faca para cortar o córtex como listras para obter fatias corticais, transferindo as fatias em média da placa de corte para uma nova placa de Petri de 35 milímetros à medida que são adquiridas. Quando todas as fatias tiverem sido coletadas, coloque a superfície cortada de cada fatia sobre uma inserção de cultura colocada em um prato de fundo de vidro contendo meio enriquecido, ajustando a orientação de cada fatia com fórceps finos conforme necessário. Em seguida, remova qualquer excesso médio com uma pipeta, e coloque o prato em uma incubadora multi-gás definida para 40% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 30 minutos.
Ao final da incubação, adicione 300 microliters de meio enriquecido suplementado com luciferina de um mililitro ao prato de cultura. Para visualizar a expressão do repórter luciferase dentro das culturas de fatia, selecione o objetivo de 40x e coloque o prato de amostra no estágio do microscópio. Adquira uma imagem de teste da fluorescência, e ajuste a posição e o plano de foco para a região de interesse sob a iluminação da luz de excitação apropriada.
Em seguida, execute a aquisição de lapso de tempo por luminescência tridimensional, fluorescência e aquisições de campo brilhante por 24 horas. Para monitorar a atividade promotora do gene oscilante Dll1, pode ser utilizada uma luciferase desestabilizada com meia-vida de cerca de 10 minutos. Como um repórter fluorescente, o repórter da luciferase pode ser usado para monitorar a dinâmica de expressão de uma proteína, sendo fundido à sequência de codificação genética de interesse.
Para visualizar a expressão de repórter no nível unicelular em culturas teciduais, o gene repórter pode ser transitoriamente transfectado em NPCs via na eletroporação uterida, como demonstrado. Além disso, a imagem baseada em microscópio permite a aquisição de imagens de campo brilhante, fluorescência e chemiluminescência. O repórter da atividade promotora DLL1 exibe uma expressão oscilatória em NPCs derivados da teleencefalo de ratos repórteres da Dll1 ubiquitinados F luciferase, com o repórter luciferase desestabilizado indicando uma regulação acentuada para cima e para baixo da expressão da atividade promotora.
Em células positivas de proteína fluorescentes verdes adjacentes que carregam células hes1 repórter e mCherry-positive expressando repórter de proteína Dll1 que fez contato entre si durante a observação, a expressão do repórter Hes1 parece começar cerca de 60 minutos após o contato, sugerindo que o atraso de tempo para a transmissão da sinalização notch entre as células adjacentes é de cerca de uma hora. Além disso, durante a transmissão de sinal, a expressão proteica Dll1 apresenta uma translocação dinâmica. Ao adquirir a imagem de bioluminescência, mantenha a sala de microscópio completamente escura, pois a luz ímpar pode impedir uma aquisição ideal.
Desenvolvimentos recentes na optogenética nos permitem controlar a expressão genética com luz. Com essa técnica, podemos simultaneamente introduzir vários padrões de expressão genética e monitorar as respostas dos repórteres da luciferase.
