この方法は、細胞増殖と分化における遺伝子発現ダイナミクスの重要性、特に神経幹細胞におけるノッチシグナル伝達分子のダイナミクスに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ライブイメージングによって非常に高精度でインビトロとインビボの両方の遺伝子発現を監視できることです。この手順を実証するのが、この新技術を開発した研究室の下條宏助教授です。
NPCへのDll1 Fルシファーゼレポーターの導入については、胚の日12.5〜14.5妊娠中のマウスでペダル反射への応答の欠如を確認してから、正中線に沿って腹部を通して2〜3センチメートルの切開を行う。切開の周りにPBS浸しガーゼを置き、リング状の鉗子を使用して慎重に右の子宮ホーンを抽出します。胚を数えた後、マイクロキャピラリーを使用して、混合Dll1 FルシフラーゼレポーターDNAの1〜2マイクロリットルを各胚のテレンセバロンの心室に注入する。
注射が成功すると、子宮の表面に青い染料が観察されます。エレクトロポレーションの場合は、PBSで子宮と電極を湿潤し、第1の胚の頭部を軽くつかむ。正に荷電した電極をDNAが注入された半球の側に設定し、30~50ボルトの50ボルトのパルスを5個提供し、パルス間に1秒間の休止を行い、負に帯電した電極から気泡が発生することを確認します。
すべての胚が注入されたら、左子宮角を腹部に戻し、17ミリメートルの針を使って4-0シルク縫合糸で切開を閉じ、閉鎖を完了する前に腹腔に温かいPBSを入れる。解離されたNPC培養を設定するには、胚の日12.5から14.5の妊娠中のDll1ユビキチン化されたルシフェラーゼトランスジェニックマウスから25ミリリットルの氷冷PBSを含む10センチメートルのペトリ皿に子宮を置き、マイクロハサミと細かい鉗子を使用して子宮から胚を取り除きます。胚を切断した後、氷冷DMEM/F12を含む新しい10センチメートルのペトリ皿に頭部を置き、各脳を取り巻く表皮および軟骨を取り除く。
3ミリリットルの氷冷N2B27培地を含む解剖顕微鏡の下で、脳を35ミリメートルの皿に移します。右と左のテレンスファロンを、ジエンスファロンから取り出します。細かい鉗子を使用して、テレンセバロンの表面を覆う髄膜を取り除き、テレンセックスの側側部分をテレンセグロンから解剖する。
目的の神経組織がすべて単離されたら、P1000ピペットを使用してサンプルを個々の1.5ミリリットルチューブに移し、P200ピペットを使用して各チューブから余分な培地を吸引します。皮質対当たり100マイクロリットルのパパイン溶液を加え、サンプルを摂氏24度で15分間置きます。インキュベーションの最後に、サンプルを新しいP1000ピペットで10回そっとピペットし、チューブを摂氏24度に戻します。
インキュベーションの終了時に、サンプルを再び穏やかにピペットしてから、遠心分離によって消化された組織を採取する。上清を吸引し、各ペレットを1ミリリットルのDMEM/F12培地で徐々に再懸濁する。サンプルをさらに3回遠心分離し、各遠心分離後に新鮮なミリリットルの培地で各ペレットを穏やかに再懸濁する。
最後の遠心分離の後、1ミリモルルシフェリンを補充したN2B27培地の500マイクロリットルのペレットを再懸濁し、各サンプルから6個の細胞に10回10回種を個々のポリLリジンコーティングガラス底皿に入れます。次いで、細胞培養インキュベーターにプレートを1時間置く。細胞が皿に付着したら、新鮮なN2B27培地と1ミリモルルシフェリンを各プレートに2ミリリットル加えます。
NPC解離培養でのルシファーゼレポーター発現を可視化するには、油浸性目的を選択し、サンプル皿を顕微鏡ステージに配置します。フィールドを手動で表示して、セルを表示するための最適な位置を決定し、対象のセルに焦点を当てます。[Live] をクリックしてテストイメージを取得し、多次元取得プログラムを使用して、2次元発光によるタイムラプス取得と明視野取得を24時間実行します。
皮質スライス培養の開発を準備するために、レポーター注射の翌日、実証されたように胚の日13.5〜14.5胚の脳を収穫し、脳を含む皿を蛍光立体顕微鏡のステージに置く。各皮質が適切な励起光の下で注入された蛍光レポーターを発現していることを確認し、脳をDMEM/F12培地の30ミリリットルで満たされたシリコーンゴム製まな板に移し、100%酸素ガスで泡立たせた。マイクロ外科用ナイフと細かい鉗子を使用して、内側と内側のテラル脳管の部分の境界を切断し、組織を2つの半球に分離する。
その後、ナイフを使用してストライプのような皮質を切断して皮質スライスを得て、取得した新しい35ミリメートルのペトリ皿にまな板から媒体でスライスを移します。すべてのスライスが収集されたら、各スライスのカット面を、濃縮された媒体を含むガラス底皿にセットされた培養インサートに置き、必要に応じて細かい鉗子で各スライスの向きを調整します。その後、ピペットで余分な培地を取り除き、40%酸素、5%の二酸化炭素、37°Cに設定したマルチガスインキュベーターに30分間皿を入れます。
インキュベーションの終わりに、培養皿に1ミリモルルシフェリンを添加した濃縮培地300マイクロリットルを加える。スライス培養物内のルシファーゼレポーターの発現を可視化するには、目的40xを選択し、サンプル皿を顕微鏡ステージに配置します。蛍光の試験画像を取得し、適切な励起光の照射下で対象領域に位置と焦点面を設定する。
次いで、3次元発光、蛍光、および明視野取得によるタイムラプス取得を24時間実行する。振動遺伝子Dll1のプロモーター活性をモニタリングするために、ユビキチン化ルシファーゼ、約10分の半減期を有する不安定化したルシファーゼレポーターを、使用することができる。蛍光レポーターと同様に、ルシファーゼレポーターは、目的の遺伝子コード配列に融合させることによってタンパク質の発現ダイナミクスを監視するために使用することができる。
組織培養における単細胞レベルでレポーター発現を可視化するために、レポーター遺伝子は、示されるように子宮エレクトロポレーションを介してNPCに一時的にトランスフェクトすることができる。さらに、顕微鏡ベースのイメージングにより、明視野、蛍光、化学発光画像の取得が可能になります。Dll1プロモーター活性のレポーターは、Dll1ユビキチン化Fルシファーゼレセレポーターマウスのテレンセバロンに由来するNPCにおける振動発現を示し、不安定化したルシファーゼレポーターはプロモーター活性の発現の急激な上下調節を示す。
観察中に互いに接触したHes1レポーターとmCherry陽性細胞とDll1タンパクレポーターを発現する隣接する強化された緑色蛍光タンパク質陽性細胞では、Hes1レポーター発現は接触後約60分開始するように見え、隣接する細胞間のノッチシグナル伝達の伝達に対する時間遅延が約1時間であることを示唆している。さらに、シグナル伝達の間、Dll1タンパク質発現は動的転座を示す。生物発光イメージングを取得する際には、余分な光が最適な取得を防ぐことができるように、顕微鏡室を完全に暗く保ちます。
光遺伝学の最近の発展は、光で遺伝子発現を制御することを可能にします。この技術により、遺伝子発現のさまざまなパターンを同時に導入し、ルシファーゼレポーターの反応を監視することができます。
