La dificultad del cultivo de Campylobacter ha inhibido estudios fundamentales como la menor cantidad de bacterias que se necesitan para producir enfermedades. Estas muestras analíticas y inventadas combinadas utilizadas aquí pueden abordar este problema. Esta técnica permite que los síntomas clínicos relevantes del paciente se correlacionen con un resultado positivo de cultivo fecal y, por primera vez, un número real de bacterias.
Aprender cuántas bacterias se correlacionan con la enfermedad proporcionará diagnóstico, un objetivo importante para la detección y un método sólido para comparar la virulencia entre cepas o especies de Campylobacter. La cultura Campylobacter es sencilla, pero requiere una preparación rápida y organizada para mantener la viabilidad cuantitativa. También se necesita un juicio considerable para identificar las colonias de Campylobacter entre la flora fecal que compite en un plato.
Antes de comenzar un cultivo de C.jejuni o C.coli, póngase guantes, una bata de laboratorio y gafas de seguridad, y coloque una hoja protectora desechable dentro de una capucha de seguridad de flujo laminar desinfectado. Usando una técnica estéril rayar cada caldo bacteriano hidratado o descongelado en una placa de agar específica de Campylobacter y colocar la placa a 37 grados Celsius durante 48 horas en un frasco anaeróbico que contiene un sobre generador de gas de atmósfera microaerbia. 24 horas más tarde, cubra libremente un matraz de caldo BHI y coloque el matraz en un frasco anaeróbico nuevo con un sobre que producirá un ambiente microeróbico para una incubación nocturna a 37 grados centígrados.
A la mañana siguiente utilizar tres mililitros del caldo pre-reducido y un bucle de inoculación para raspar la placa de arranque de la cultura Campylobacter. Transfiera la suspensión a un tubo estéril e inocular los 97 mililitros restantes del caldo pre-reducido con los tres mililitros de lodos raspados. Coloque el caldo en el frasco con el sobre de gas e incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 115 revoluciones por minuto en una incubadora de temblores durante 48 a 72 horas, hasta que el cultivo alcance una densidad óptica a 600 nanómetros de no más de 4.
Para establecer el número de bacterias en este cultivo de stock puro realizar ocho series de dilución 10 veces de 100 microlitros de caldo en 900 microlitros de dilución. Usando perlas de chapa estéril, esparza 100 microlitros de uno por 10 a la quinta negativa a la 10 a la séptima diluciones negativas en placas específicas de Campylobacter pre-reducidas duplicadas y placas de etiquetas con la concentración de dilución antes de colocar las placas en un segundo frasco anaerobio con un sobre generador de gas durante 48 a 72 horas a 37 grados Celsius. Al final del período de crecimiento seleccionar placas con entre 30 a 300 colonias para el conteo.
Después de contar, utilice los recuentos para determinar las unidades formadoras de colonias por mililitro del cultivo del caldo de stock de acuerdo con la fórmula. Es fundamental que los recuentos de colonias analíticas sean precisos, ya que esto sustenta todos los pasos que utilizan la piscina fecal con púas. Inmediatamente después del chapado para contar como se ha demostrado, mezcle volúmenes iguales de caldo y campylobacter piscina fecal negativa y haga nueve diluciones dobles posteriores en la piscina fecal negativa, añadiendo una placa de control con caldo que no contenga Campylobacter a la piscina fecal para ayudar a identificar las colonias no campylobacter.
Raya 10 microlitros de cada dilución de heces De Campylobacter en placas de agar específicas de Campylobacter pre-reducidas duplicadas e incubar las placas en frasco anaeróbico con un sobre generador de gas a 37 grados Celsius durante aproximadamente 48 horas. Al final de la incubación examina visualmente las placas rayadas en busca de colonias que se asemejan a las de las culturas puras de Campylobacter. Para confirmar que las colonias son en realidad Campylobacter seleccionar múltiples Campylobacter como colonias para la tinción de gramos y visualizar un área delgadamente rayada por microscopía de luz utilizando una lente de inmersión de aceite para identificar bacterias pequeñas curvas gram-negativas, espirales o en forma de cigarro.
Una placa de control negativa sin Campylobacter añadido es importante para ayudar a identificar otras flora fecales. Considere la última dilución que contiene una colonia gramnegativa similar a Campylobacter el límite de la detección de cultivo. Y utilice la fórmula para calcular las unidades formadoras de colonias por mililitro de la dilución positiva en muestras fecales clínicas inventadas.
Para determinar la viabilidad de Campylobacter almacenado en medio de transporte mezclar un mililitro de cultivo de caldo Campylobacter con un mililitro de piscina fecal negativa y preparar 10 diluciones seriales duplicadas dobles en piscina fecal negativa. Diluir aún más cada dilución en una proporción adicional de uno a cuatro en el medio Cary-Blair y almacenar los 20 tubos de dilución y un control negativo en el medio Cary-Blair en tubos de tapa a dos a ocho grados celsius durante 96 horas. A partir del tiempo cero y cada 24 horas a partir de entonces raya 10 microlitros alícuotas de cada dilución en placas de agar selectivo Campylobacter e incuba las placas a 37 grados Celsius durante 48 horas.
Como no existe un método independiente para establecer números bacterianos precisos a partir de muestras de pacientes, se pueden realizar dos mediciones simultáneas con un stock bacteriano puro. Una prueba se utiliza para la detección visual de colonias de Campylobacter a partir de diluciones seriales de la bacteria en una matriz fecal, simulando muestras clínicas. La otra prueba se utiliza analíticamente, cuantificar las unidades formadoras de colonias por mililitro presente en el mismo cultivo de bacterias utilizado para el pico.
Un parámetro clave para el éxito es identificar las colonias de tamaño preciso entre la flora fecal competidora, como lo ilustra esta placa representativa del cultivo de heces espiadas. Aquí, se pueden observar datos típicos de siete experimentos independientes. No basta con identificar colonias que se asemejan a Campylobacter dentro de las culturas fecales.
Todas las colonias deben confirmarse con manchas de gramo o métodos más avanzados. Utilizamos un inmunoensayo enzimático que es más preciso que el cultivo para detectar especies poco comunes como C.upsaliensis o C.lari, que crecen mal con el agar que contiene antibióticos estándar. Esta técnica sienta una base necesaria para estudiar cosas como el transporte no sintomático de Campylobacter y si las altas cargas bacterianas ponen a un paciente en mayor riesgo de consecuencias graves de la infección por Campylobacter.
Use siempre EPP cuando trabaje con bacterias, que a menudo son infecciosas y pueden ser peligrosas, y con la piscina fecal negativa que puede contener patógenos desconocidos incluso cuando se recogen de donantes sanos.
