La difficulté de la culture Campylobacter a inhibé des études fondamentales telles que le peu de bactéries nécessaires pour produire des maladies. Ces échantillons analytiques et artificiels combinés utilisés ici peuvent résoudre ce problème. Cette technique permet de corréler les symptômes cliniques pertinents du patient avec un résultat positif de culture fécale et pour la première fois, un nombre réel de bactéries.
L’apprentissage du nombre de bactéries corrélées avec la maladie fournira des diagnostics, un objectif important pour la détection et une méthode solide pour comparer la virulence entre les souches ou les espèces de Campylobacter. La culture Campylobacter est simple, mais elle nécessite une préparation rapide et organisée pour maintenir la viabilité quantitative. Un jugement considérable est également nécessaire pour identifier les colonies de Campylobacter parmi la flore fécale concurrente sur une plaque.
Avant de commencer une culture C.jejuni ou C.coli, enduire des gants, un manteau de laboratoire et des lunettes de sécurité, et placer une feuille de protection jetable dans un capot désinfecté de sécurité de flux laminaire. En utilisant la technique stérile strie chaque stock bactérien hydraté ou décongelé sur une plaque d’agar spécifique Campylobacter et placer la plaque à 37 degrés Celsius pendant 48 heures dans un bocal anaérobie contenant un sachet générateur de gaz de l’atmosphère microaérobie. 24 heures plus tard, recouvrez lâchement un flacon de bouillon BHI et placez le flacon dans un nouveau bocal anaérobie avec un sachet qui produira un environnement microaérobie pour une incubation nocturne à 37 degrés Celsius.
Le lendemain matin, utilisez trois millilitres de bouillon pré-réduit et une boucle d’inoculation pour gratter la plaque de démarrage de la culture Campylobacter. Transférer le lisier dans un tube stérile et inoculer les 97 millilitres restants du bouillon pré-réduit avec les trois millilitres de boue grattée. Placer le bouillon dans le bocal avec le sachet de gaz et incuber la culture à 37 degrés Celsius et 115 révolutions par minute sur un incubateur secouant pendant 48 à 72 heures, jusqu’à ce que la culture atteigne une densité optique à 600 nanomètres d’au plus 4.
Pour établir le nombre de bactéries dans cette culture de stock pur effectuer huit séries de dilution 10 fois de 100 microlitres de bouillon dans 900 microlitres de dilution. À l’aide de perles stériles de placage, répartir 100 microlitres de l’une fois 10 au cinquième négatif à la 10 à la négatif septième dilutions sur les plaques spécifiques campylobacter pré-réduites en double et les plaques d’étiquette avec la concentration de dilution avant de placer les plaques dans un deuxième bocal anaérobie avec un sachet générateur de gaz pendant 48 à 72 heures à 37 degrés Celsius. À la fin de la période de croissance, sélectionnez des plaques comptant entre 30 et 300 colonies à compter.
Après compter utiliser les dénombrements pour déterminer la colonie formant des unités par millilitre de la culture du bouillon de stock selon la formule. Il est essentiel que le nombre de colonies analytiques soit exact, car cela sous-tend toutes les étapes à l’aide d’un pool fécal à pointes. Immédiatement après placage pour compter comme démontré, mélanger des volumes égaux de bouillon et campylobacter piscine fécale négative et faire neuf dilutions subséquentes doubles dans la piscine fécale négative, en ajoutant une plaque de contrôle avec du bouillon ne contenant pas de Campylobacter à la piscine fécale pour aider à identifier les colonies non Campylobacter.
Streak 10 microlitres de chaque dilution des selles Campylobacter sur les plaques d’agar spécifiques campylobacter pré-réduites en double et incuber les plaques dans un bocal anaérobie avec un sachet générateur de gaz à 37 degrés Celsius pendant environ 48 heures. À la fin de l’incubation, examinez visuellement les plaques striées pour les colonies ressemblant à celles des cultures campylobacter pures. Pour confirmer que les colonies sont en fait Campylobacter sélectionner plusieurs Campylobacter comme des colonies pour la coloration gram et visualiser une zone légèrement striée par microscopie légère à l’aide d’une lentille d’immersion d’huile pour identifier gram-négatif incurvé, spirale, ou cigare en forme de petites bactéries.
Une plaque de contrôle négative sans campylobacter ajouté est important pour aider à identifier d’autres flores fécales. Considérez la dernière dilution qui contient une colonie gramnégative visuelle de campylobacter-comme la limite de détection de culture. Et utilisez la formule pour calculer les unités de formation de colonie par millilitre de la dilution positive dans le spécimen fécal clinique artificiel.
Pour déterminer la viabilité de Campylobacter stocké dans le mélange moyen de transport d’un millilitre de culture de bouillon Campylobacter avec un millilitre de piscine fécale négative et préparer 10 dilutions en série doubles en double dans la piscine fécale négative. Diluer davantage chaque dilution à un rapport supplémentaire de un à quatre dans le milieu Cary-Blair et stocker les 20 tubes de dilution et un contrôle négatif dans cary-Blair moyen dans les tubes de bouchon à deux à huit degrés Celsius pendant 96 heures. À partir du moment zéro et toutes les 24 heures par la suite strie 10 aliquots microliter de chaque dilution sur campylobacter plaques d’agar sélectives et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.
Comme il n’existe pas de méthode indépendante pour établir des nombres bactériens précis à partir d’échantillons de patients, deux mesures simultanées peuvent être effectuées avec un seul stock bactérien pur. Un test est utilisé pour la détection visuelle des colonies de Campylobacter à partir de dilutions en série des bactéries stock dans une matrice fécale, simulant des spécimens cliniques. L’autre test est utilisé analytiquement, quantifier les unités formant la colonie par millilitre présent dans la même culture de stock de bactéries utilisée pour piquer.
Un paramètre clé pour le succès est d’identifier les colonies de taille précise parmi la flore fécale concurrente, comme l’illustre cette plaque représentative de la culture des selles à pointes. Ici, les données typiques de sept expériences indépendantes peuvent être observées. Il ne suffit pas d’identifier les colonies qui ressemblent à Campylobacter dans les cultures fécales.
Toutes les colonies doivent être confirmées avec des taches de gramme ou des méthodes plus avancées. Nous utilisons une immunoassay enzymatique qui est plus précise que la culture pour détecter des espèces rares telles que C.upsaliensis ou C.lari, qui poussent mal sur l’antibiotique standard contenant de l’agar. Cette technique pose les bases nécessaires pour étudier des choses comme le transport non symptomatique de Campylobacter et si des charges bactériennes élevées mettent un patient à risque plus élevé de conséquences graves de l’infection de Campylobacter.
Portez toujours des EPI lorsque vous travaillez avec des bactéries, qui sont souvent infectieuses et peuvent être dangereuses, et avec le pool fécal négatif qui peut contenir des agents pathogènes inconnus, même lorsqu’ils sont recueillis auprès de donneurs en bonne santé.
