Las matrices de microtúbulos celulares contienen subpoblaciones de microtúbulos con propiedades dinámicas distintas según sea necesario para la función. Este protocolo aborda cómo la actividad colectiva de los reguladores otorga a las subpoblaciones de microtúbulos proximales propiedades distintas. Este ensayo de restitución de abajo hacia arriba nos permite visualizar simultáneamente la organización y la dinámica de las poblaciones de microtúbulos proximales, como los microtúbulos y los haces individuales, y descifrar los mecanismos subyacentes a su autoorganización.
La reconstitución de múltiples componentes requiere optimizar parámetros experimentales como el pH, la fuerza iónica y la concentración de proteínas, preservando al mismo tiempo la actividad de cada uno. El análisis sistemático de componentes individuales antes de los ensayos de múltiples proteínas es extremadamente útil. Para comenzar, pipetee una mezcla de 4,5 microlitros de BRB ADDTT en un microlitro de solución de microtúbulos en un portaobjetos de microscopio.
Cubra con una cubierta de 18 por 18 milímetros y selle los bordes con esmalte de uñas transparente o sellador VALAP. Coloque el objetivo TIRF debajo del cobertor. Visualice los microtúbulos recién polimerizados a una longitud de onda apropiada para la tubulina marcada fluorescentemente en la mezcla brillante para determinar qué dilución de microtúbulos usar en los próximos experimentos.
Determine empíricamente la intensidad del láser para el experimento de modo que todas las proteínas fluorescentes estén iluminadas, pero no se sometan a un fotoblanqueo significativo en el transcurso del experimento. Ajuste la temperatura del microscopio a 28 grados Celsius para ver microtúbulos dinámicos. Use papel de lente para limpiar un objetivo 100X con 70% de etanol.
Utilice la mejor combinación de cubos de filtro y filtros de emisión dependiendo de los canales fluorescentes a fotografiar. Configure la secuencia de imágenes. Para un experimento con microtúbulos biotinilados marcados con fluoróforos de 647 nanómetros, microtúbulos no biotinilados marcados con fluoróforos de 560 nanómetros en tubulina soluble y proteína de interés marcada con GFP, obtenga imágenes de los canales de 488 nanómetros, 560 nanómetros y 647 nanómetros cada 10 segundos durante 20 minutos.
Para capturar una imagen de referencia de haces antes de la adición de tubulina soluble y proteína asociada a microtúbulos, configure una secuencia con una imagen cada uno en canales de longitud de onda de 560 nanómetros y 647 nanómetros. Verifique la posición del rayo láser en el techo sobre el microscopio y realice cambios en el haz utilizando un software. Asegúrese de que el iluminador láser esté alineado.
Antes de tomar imágenes, agregue una gota de aceite de inmersión de microscopio al objetivo. Prepare la mezcla de tubulina soluble mientras la mantiene en hielo y haga girar la mezcla. Para inmovilizar microtúbulos a través del enlace biotina-NeutrAvidin-biotina, primero fluya en aproximadamente 7,5 microlitros de solución de NeutrAvidin hasta que la cámara se llene e incube durante cinco minutos.
Lavar con 10 microlitros de MB de frío. Fluye en 7,5 microlitros de la proteína bloqueadora KC e incuba durante dos minutos. Lavar con 10 microlitros de MB calientes para preparar la cámara para la introducción de microtúbulos.
Diluya el stock de microtúbulos biotinilados en BRB ADDTT y agregue un microlitro de esta dilución a nueve microlitros de MB calientes. Vierta la mezcla en la cámara e incube durante 10 minutos. Lave los microtúbulos no inmovilizados con 10 microlitros de MB calientes.
Fluya 7.5 microlitros de KC caliente en la cámara e incube durante dos minutos. Durante la incubación, prepare una solución de dos nanomolares del reticulado o proteína PRC1 en KC y haga girar la solución. Fluya 10 microlitros de esta solución en la cámara de imágenes e incube durante cinco minutos.
Para hacer haces, fluya 10 microlitros de microtúbulos no biotinilados en la cámara e incube durante 10 minutos. Lavar la cámara dos veces con 10 microlitros de MB calientes. Durante el tiempo de incubación de 10 minutos, prepare 10 microlitros de mezcla de ensayo que contenga proteínas de interés, tubulina soluble, nucleótidos, eliminadores de oxígeno y antioxidantes y hágalo girar.
Mantenga la mezcla en hielo. Cargue la cámara de imagen preparada pegada al soporte deslizante en el objetivo 100X TIRF. Utilice los canales de 560 nanómetros y 647 nanómetros para encontrar un campo de visión que contenga un número y una densidad óptimos de microtúbulos y haces individuales.
Una vez que se identifica un campo de visión, tome una imagen de referencia. Fluya cuidadosamente en la mezcla de ensayo sin perturbar la cámara de imágenes. Selle los extremos abiertos de la cámara con sellador VALAP.
Observe los microtúbulos e inicie la secuencia de imágenes. Después de inmovilizar las semillas de microtúbulos y generar haces, se obtuvieron imágenes de fluorescencia. Los microtúbulos individuales se identificaron por señal fluorescente en el canal de 647 nanómetros, mientras que los microtúbulos se identificaron como haces preformados cuando mostraban señales fluorescentes en ambos canales.
La dinámica de los microtúbulos individuales y los haces reticulados PRC1 se estudiaron en presencia de las proteínas KIF4A y CLASP1, lo que reveló que los microtúbulos individuales se alargan en el transcurso del ensayo, mientras que el crecimiento de los microtúbulos reticulados está estancado. Tenga cuidado de mantener los microtúbulos polimerizados a temperatura ambiente o por encima de ella. Mantenga la tubulina soluble en hielo y proteja la cámara de imágenes y los microtúbulos y proteínas marcados fluorescentemente de la luz.
Estos ensayos proporcionaron una visión mecanicista de cómo un módulo de proteínas que se encuentra en el huso mitótico podría regular diferencialmente la dinámica de dos poblaciones diferentes de microtúbulos que coexisten en el huso.
