我々のプロトコルは、ECMが古典的なアディポジェニックメディエーターの不在時に有数分化を促進する可能性があることを示し、ECMによる細胞代謝の疾患特異的調節を実証する最初の。我々の技術は、脂肪組織代謝におけるECMおよび脂肪細胞の役割を解剖するためのツールを提供し、脂肪組織の恒常性を調節するECMの役割の研究を可能にする。標準的な2D細胞培養と比較して、当社の3Dモデルは、2型糖尿病の文脈における脂肪細胞と脂肪組織ECMの間のクロストークのより堅牢な検査と解剖を可能にします。
小さいサンプルから始め、細胞化の度合いを測定することをお勧めします。細胞の成長の度合いと組織の脱細胞化には、患者間のばらつきがあることを覚えておいてください。各ステップの前後に組織を観察して、組織が脱細胞化されていることを確認し、サンプル間の潜在的な違いを理解することが重要です。
手術から内臓脂肪組織またはVATを得た後、50ミリリットル円錐形チューブ内の凍結緩衝液の15〜25ミリリットルに組織の5〜10グラムを追加することによって貯蔵のためにそれを準備します。完全にサンプルを浸し、脱細胞化するまでマイナス80°Cで保存します。プリディポサイトの分離のために、コラゲターゼII型溶液の20ミリリットルに無傷のVATの新鮮なサンプルの2グラムを入れてから、チューブに滅菌ハサミを挿入し、組織を徹底的にミンチします。
細かいスラリーにひき刻んだら、軌道シェーカーで37°Cのコラゲナーゼ溶液に60分間インキュベートします。インキュベーション後、100マイクロメートルのナイロンメッシュを通して消化した結果を、新鮮な50ミリリットルの円錐形チューブにフィルター処理します。消化されたのは、適度な粘度と未消化組織の残留鎖の少量を持つ黄色オレンジ色の液体である必要があります。
サンプルを270回gで10分間遠心し、上清を取り除き、ピペットで1X RBC溶解溶液の2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。25°Cで1分間溶液をインキュベートし、15%FBS DMEM F12の10ミリリットルを加え、270回gで10分間遠心分離機を加えます。ECMを準備するには、定期的に穏やかな手動攪拌で20分間予熱水浴中でそれをインキュベートすることによって、以前に凍結したVATサンプルを摂氏37度に凍結/解凍します。
解凍したら、組織をマイナス80度に20分間戻し、解凍で終わる凍結/解凍プロセスを3回繰り返します。滅菌鉗子を使用して、15〜25ミリリットルの酵素溶液1を含む新鮮な50ミリリットルの円錐チューブにVATサンプルを移し、サンプルが完全に浸漬されていることを確認します。その後、130 RPMで振りながら摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日、15~25ミリリットルのリンスバッファー溶液でサンプルを3回洗浄し、洗浄後に溶液を注ぎます。サンプルを15~25ミリリットルの酵素溶液2で新鮮な50ミリリットルチューブに移し、一晩インキュベートします。リンスバッファー溶液でのこの溶液の化しを繰り返し、極性溶媒抽出液の15〜25ミリリットルを含む新鮮なチューブにサンプルを移します。
振りながら一晩サンプルをインキュベートします。極性溶媒溶液でインキュベーションした後、脂質除去のためにサンプルを調べることが重要である。脂質の大部分が除去されない場合、この工程を繰り返す必要がある場合がある。
より短いインキュベーション時間が使用されてもよい。インキュベーション後、15〜25ミリリットルのリンスバッファー溶液を含む新鮮なチューブにサンプルを移し、シェーカーでサンプルを3回洗浄します。その後、試料を70%エタノール溶液で3回洗浄し、各洗浄後にエタノールを注ぎ出す。
サンプルを保存液で1回洗浄し、滅菌鉗子を使用して15〜25ミリリットルの貯蔵溶液を含む新鮮なチューブに移し、完全に浸漬してください。その後、サンプルは摂氏4度で最大1ヶ月間保存できます。イソプロパノールおよびエタノールは可燃性であり、室温で、可燃性廃棄物に廃棄されなければならない。
人間の廃棄物は、通常のバイオハザード廃棄物とは別に処分する必要があります。保存されたECMフラグメントを、計画された下流アッセイに必要な数の断片を追加する無菌鉗子を備えた24ウェルプレートの個々の井戸に移します。軌道シェーカーで500マイクロリットルの70%エタノールで3回洗浄し、PBSで3回洗浄して水分補給します。
100ミリグラムの断片にECMをカットするために滅菌はさみを使用してください。各断片を24ウェルプレートの1つの井戸に入れ、プレートを摂氏25度で15分間インキュベートし、余分なPBSが断片から押し出されるようにします。その後、慎重にピペットで井戸から残ったPBSを削除します。
各断片に20マイクロリットルのプリディポサイト細胞懸濁液を播種し、細胞をECMに直接ピペット化します。ピペットチップをECMに入れ、マトリックスの中央にそっと出して、細胞懸濁液があふれないようにして、ウェルの底部に落とします。セル懸濁液が ECM からオーバーフローする場合は、その位置からピペットチップを取り外し、ECM 内の他の場所に挿入します。
細胞播種後、摂氏37度で40分間ECMをインキュベートする。500マイクロリットルの成長培地を各ウェルに充填し、シードされたECMフラグメントをカバーします。細胞を摂氏37度、炭酸ガス5%で72時間培養します。
72時間後、ECM断片を乱さずに成長培地を慎重に吸引する。500マイクロリットルの分化培地を加え、2~3日ごとに培地を交換して14日間細胞を培養します。光顕微鏡を使用して分化を確認します。
細胞は脂質を蓄積し、色が茶色に変わり、分化するにつれてより球状になります。脂肪組織ECMの調製、前準備細胞による播種、および成熟脂肪細胞へのインビトロ分化を、ECMの脱細胞化及び再播種および分化時に脂肪細胞を含む脂質の再キャパライズを明らかにした走査型電子顕微鏡でモニタリングした。脱細胞化ECMのコラーゲン1特異的免疫細胞化学はコラーゲンマイクロアーキテクチャの維持を示し、一方で、生および固定された3D ECM-脂肪細胞構築物のオイルレッドO染色は脂肪細胞を含む脂質を示した。
ECMで分化したアディポサイトを定量リアルタイムPCRを用いてアディポジェニック遺伝子についてスクリーニングし、これらの遺伝子がECMで培養された未分化前置細胞に対して分化細胞でアップレギュレートされていることを実証した。トランスクリプトレベルの全差が示される。糖尿病および非糖尿病の被験者からのECMおよびアディポサイトの4つの組み合わせが代謝型のフェノタイピングを行った。
脂肪分解機能におけるグルコース取り込み障害は、糖尿病組織からの構築物で発見された。重要なことに、糖尿病性ECMは、糖尿病脂肪細胞におけるインスリン刺激グルコース取り込みおよび脂肪量を救うことが判明した。分離された前読細胞、脱細胞化組織、および再播種されたECMの汚染は珍しくない。
無菌性は、プロトコル全体を通して熱心に維持されなければならない。
