הפרוטוקול שלנו מדגים כי ה- ECM עשוי לקדם התברואה אדיפוגנית בהיעדר מתווכים אדיפוגניים קלאסיים והוא הראשון להדגים ויסות ספציפי למחלות של חילוף החומרים התאי על ידי ה- ECM. הטכניקה שלנו מספקת כלי לנתח את התפקידים של ECM ו adipocytes בחילוף החומרים של רקמת שומן ולהתיר מחקר של התפקיד של ECM בוויסות הומאוסטזיס רקמת שומן. בהשוואה לתרבות תאים דו-ממד סטנדרטית, מודל התלת-ממד שלנו מאפשר בדיקה חזקה יותר וניתוס של דיבור צולב בין אדיפוזיטים לרקמת שומן ECM בהקשר של סוכרת מסוג 2.
אנו ממליצים להתחיל עם דגימות קטנות יותר כדי לאמוד כמה טוב זה תאית. זכור שיש שונות בין אשפוז כמה טוב התאים גדלים וכמה טוב הרקמה decellularizes. חשוב לבחון את הרקמה לפני ואחרי כל שלב כדי להבטיח את הרקמה הופכת decellularized ולהבין הבדלים פוטנציאליים בין דגימות.
לאחר קבלת רקמת שומן הקרביים או מע"מ מניתוח, להכין אותו לאחסון על ידי הוספת 5-10 גרם של הרקמה ל 15-25 מיליליטר של פתרון חיץ הקפאה בצינור חרוט 50 מיליליטר. טובלים לחלוטין את הדגימה ומאחסנים אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לדקלולריזציה. לבידוד preadipocyte, מניחים שני גרם של מדגם טרי של מע מ שלם ב 20 מיליליטר של פתרון קולגנס מסוג II, ולאחר מכן להכניס מספריים סטריליים לתוך הצינור ביסודיות טחון הרקמה.
לאחר טחון תרחיף בסדר, דגירה אותו בתסמת קולגן ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית במשך 60 דקות. לאחר הדגירה, לסנן את וכתוצאה מכך מתעכל דרך רשת ניילון 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוט טרי 50 מיליליטר. מתעכל צריך להיות נוזל צהוב כתום עם צמיגות מתונה כמות קטנה של גדילים שיורית של רקמה מעוכלת.
צנטריפוגה המדגם ב 270 פעמים g במשך 10 דקות, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא בשני מיליליטר של פתרון 1X RBC lysing עם פיפטה. דגירה הפתרון במשך דקה אחת ב 25 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של 15% FBS DMEM F12 צנטריפוגה זה 270 פעמים g במשך 10 דקות. כדי להכין את ECM, להקפיא / להפשיר את דגימת המע"מ שהוקפאה בעבר ל 37 מעלות צלזיוס על ידי דגירה אותו באמבט מים מחומם מראש במשך 20 דקות עם תסיסה ידנית עדינה תקופתית.
לאחר הפשרה, להעביר את הרקמה בחזרה מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולחזור על תהליך ההקפאה / הפשרה שלוש פעמים שהסתיימו עם הפשרה. השתמש במדפים סטריליים כדי להעביר את דגימת המע"מ לצינור חרוט טרי של 50 מיליליטר המכיל 15-25 מיליליטר של פתרון אנזימטי 1 כדי לוודא שהדגימה שקועה במלואה. ואז להדקר אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 130 סל"ד.
ביום שלמחרת, לשטוף את המדגם שלוש פעמים עם 15-25 מיליליטר של פתרון חיץ שטיפה, לשפוך את הפתרון לאחר כל לשטוף. מעבירים את הדגימה לצינור טרי של 50 מיליליטר עם 15-25 מיליליטר של פתרון אנזימטי 2 ודגירה אותו בן לילה. חזור על השטיפה עם פתרון חיץ השטיפה והעבר את הדגימה לצינור טרי המכיל 15-25 מיליליטר של פתרון מיצוי ממס קוטבי.
הדגירה את הדגימה לילה תוך כדי רעידות. לאחר הדגירה עם פתרון ממס הקוטב, חשוב לבחון את המדגם להסרת השומנים. אם רוב השומנים אינם מוסרים, ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלב זה.
ניתן להשתמש בזמן דגירה קצר יותר. לאחר הדגירה, מעבירים את הדגימה לצינור טרי המכיל 15-25 מיליליטר של פתרון חיץ שטיפה ושוטפים את הדגימה שלוש פעמים על השייקר. לאחר מכן לשטוף את הדגימה שלוש פעמים עם 70% פתרון אתנול, לשפוך את האתנול לאחר כל לשטוף.
לשטוף את המדגם פעם אחת עם פתרון אחסון, ולאחר מכן להשתמש מטליות סטריליות להעביר צינור טרי המכיל 15-25 מיליליטר של פתרון אחסון הקפדה לטבול אותו באופן מלא. לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס עד חודש. Isopropanol ואתנול הם דליקים חייב להיות בטמפרטורת החדר להיפטר פסולת דליקה.
כל פסולת אנושית חייבת להיות מסולקת בנפרד מהפסולת הביולוגית הרגילה. העבר את שברי ECM המאוחסנים ל בארות בודדות של צלחת 24 בארות עם מדפים סטריליים הוספת שברים רבים כנדרש עבור המטענים במורד הזרם המתוכנן. לשטוף אותם שלוש פעמים עם 500 microliters של 70% אתנול על שייקר מסלולית, ולאחר מכן rehydrate אותם על ידי שטיפה שלוש פעמים עם PBS.
השתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך את ECM לרסיסים 100 מיליגרם. מניחים כל שבר לתוך באר אחת של צלחת 24 היטב דגירה את הצלחת ב 25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאפשר PBS עודף להתבלט מן השברים. ואז להסיר בזהירות כל שאריות PBS מן הבארים עם פיפטה.
זרע כל שבר עם 20 microliters של השעיית תא preadipocyte על ידי צינורות התאים ישירות לתוך ECM. מניחים את קצה פיפטה ב- ECM ומסלקים אותו בעדינות למרכז המטריצה ומוודאים כי מתלי התא אינם גולשים ומסתיימות בתחתית הבאר. אם ההשעיה של התא גולשת מה- ECM, הסר את קצה הפיפסה ממיקום זה והוסף אותו למקום אחר ב- ECM.
לאחר זריעת התא, הדגירה ECM במשך 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מלאו כל באר ב-500 מיקרוליטרים של מדיית צמיחה כדי לכסות את שברי ה-ECM. תרבו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 72 שעות.
לאחר 72 שעות, שאף בזהירות את תקשורת הצמיחה מבלי להפריע לרסיס ה-ECM. הוסף 500 microliters של מדיה התברואה ותרבות התאים במשך 14 ימים שינוי המדיה כל יומיים עד שלושה ימים. בדוק אם יש התבידול באמצעות מיקרוסקופיה קלה.
תאים יצברו שומנים, יהפכו בצבע חום-צהוב ויהפכו כדוריים יותר ככל שהם מבדילים. הכנת ECM רקמת שומן, זריעה עם preadipocytes, בידול במבחנה לתוך adipocytes בוגרת היה במעקב עם סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים אשר חשף decellularization של ECM ו recapitulation לאחר מכן של שומנים המכילים adipocytes על reseeding והתמדה. קולגן 1 אימונוהיסטוכימיה ספציפית של ECM decellularized הראה תחזוקה של ארכיטקטורת מיקרו קולגן בעוד שמן אדום-O כתמים של מבנים חיים קבועים 3D ECM-adipocyte הראו שומנים המכילים adipocytes.
האדיפוזיטים המובחנים ב- ECM הוסכו עבור גנים אדיפוגניים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת שהוכיח כי גנים אלה מוסדרים בתאים המובחנים ביחס לקדם-אדישות מובחנת בתרבות ב- ECM. ההבדל המלא ברמות התמליל מוצג. ארבעה שילובים של ECM ואדיפוזיטים מנבדקים סוכרתיים ולא סוכרתיים היו נתונים לפנוטיפים מטבוליים.
ספיגת גלוקוז לקויה בתפקוד ליפוליטי התגלתה במבנונים מרקמות סוכרתיות. חשוב לציין, נמצא כי ECM לא סוכרתי מציל ספיגת גלוקוז מגורה אינסולין וקיבולת lipolytic בדיפוזיטים סוכרתיים. זיהום של preadipocytes מבודד, הרקמה decellularized, ו ECM reseeded אינו נדיר.
סטריליות חייבת להישמר בחריצות לאורך כל הפרוטוקול.
