Unser Protokoll zeigt, dass das ECM die adipogene Differenzierung in Ermangelung klassischer adipogener Mediatoren fördern kann und ist das erste, das eine krankheitsspezifische Regulierung des Zellstoffwechsels durch das ECM demonstriert. Unsere Technik bietet ein Werkzeug, um die Rolle des ECM und der Adipozyten im Fettgewebestoffwechsel zu sezieren und ermöglicht eine Untersuchung der Rolle des ECM bei der Regulierung der Darmgewebehomöostase. Im Vergleich zur Standard-2D-Zellkultur ermöglicht unser 3D-Modell eine robustere Untersuchung und Dissektion von Quergesprächen zwischen Adipozyten und Fettgewebe ECM im Zusammenhang mit Typ-2-Diabetes.
Wir empfehlen, mit kleineren Proben zu beginnen, um zu messen, wie gut es zellularisiert ist. Denken Sie daran, es gibt intergeduldige Variabilität, wie gut die Zellen wachsen und wie gut das Gewebe dezellularisiert. Es ist wichtig, das Gewebe vor und nach jedem Schritt zu beobachten, um sicherzustellen, dass das Gewebe dezellularisiert wird und mögliche Unterschiede zwischen den Proben zu verstehen.
Nach Erhalt viszeralen Fettgewebe oder MwSt aus der Chirurgie, bereiten Sie es für die Lagerung durch Zugabe von 5-10 Gramm des Gewebes zu 15-25 Milliliter Gefrierpuffer Lösung in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Die Probe vollständig eintauchen und bei minus 80 Grad Celsius bis zur Dezellularisierung lagern. Für die Präsipozytenisolierung zwei Gramm einer frischen Probe intakter Mehrwertsteuer in 20 Milliliter Kollagenase Typ II Lösung legen, dann sterile Schere in das Rohr einlegen und das Gewebe gründlich zerkleinern.
Einmal zu einer feinen Gülle gehackt, inkubieren Sie es in der Kollagenase-Lösung bei 37 Grad Celsius auf einem Orbital-Shaker für 60 Minuten. Filtern Sie nach der Inkubation den resultierenden Durchdimaute durch ein 100 Mikrometer Nylongewebe in ein frisches 50-Milliliter-Konusrohr. Die verdaut sollte eine gelb-orange Flüssigkeit mit mäßiger Viskosität und einer kleinen Menge an Reststrängen von unverdautem Gewebe sein.
Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 270 mal g, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in zwei Millilitern 1X RBC-Lysinglösung mit einer Pipette wieder auf. Inkubieren Sie die Lösung für eine Minute bei 25 Grad Celsius, dann fügen Sie 10 Milliliter 15%FBS DMEM F12 und Zentrifugieren Sie es bei 270 mal g für 10 Minuten. Um das ECM vorzubereiten, frieren/tauen Sie die zuvor eingefrorene Mehrwertsteuerprobe auf 37 Grad Celsius ein, indem Sie sie in einem vorgeheizten Wasserbad 20 Minuten lang mit periodisch schonender manueller Rührung bebrüten..
Nach dem Auftauen das Gewebe für 20 Minuten wieder auf minus 80 Grad Celsius übertragen und den Frost-/Tauvorgang dreimal wiederholen und mit dem Auftauen enden. Verwenden Sie sterile Zangen, um die MwSt.-Probe in ein frisches 50-Milliliter-Konusrohr mit 15-25 Millilitern enzymatischer Lösung 1 zu übertragen, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig eingetaucht ist. Dann inkubieren Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius, während es bei 130 RPM schüttelt.
Am nächsten Tag die Probe dreimal mit 15-25 Millilitern Spülpufferlösung waschen und die Lösung nach jeder Wäsche abgießen. Die Probe in ein frisches 50-Milliliter-Rohr mit 15-25 Millilitern enzymatischer Lösung 2 geben und über Nacht inkubieren. Wiederholen Sie die Waschungen mit der Spülpufferlösung und übertragen Sie die Probe in ein frisches Rohr mit 15-25 Millilitern polarer Lösungsmittelextraktionslösung.
Inkubieren Sie die Probe über Nacht beim Schütteln. Nach der Inkubation mit der polaren Lösungsmittellösung ist es wichtig, die Probe auf Lipidentfernung zu untersuchen. Wenn der größte Teil des Lipids nicht entfernt wird, kann es notwendig sein, diesen Schritt zu wiederholen.
Es kann eine kürzere Inkubationszeit verwendet werden. Nach der Inkubation die Probe in ein frisches Rohr mit 15-25 Millilitern Spülpufferlösung geben und die Probe dreimal auf dem Shaker waschen. Dann waschen Sie die Probe dreimal mit 70% Ethanol-Lösung, gießen Sie das Ethanol nach jedem Waschen.
Waschen Sie die Probe einmal mit Lagerungslösung, dann verwenden Sie sterile Zangen, um in ein frisches Rohr mit 15-25 Milliliter LagerungLösung zu übertragen, um sicherzustellen, dass sie vollständig eingetaucht. Die Probe kann dann bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius gelagert werden. Das Isopropanol und Ethanol sind entzündlich und müssen bei Raumtemperatur sein und in brennbaren Abfällen entsorgt werden.
Alle menschlichen Abfälle müssen getrennt von den üblichen Bioabfallabfällen entsorgt werden. Übertragen Sie die gespeicherten ECM-Fragmente auf einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte mit sterilen Zangen, die so viele Fragmente hinzufügen, wie für die geplanten downstream-Assays erforderlich sind. Waschen Sie sie dreimal mit 500 Mikrolitern 70%Ethanol auf einem Orbital-Shaker, dann rehydrieren Sie sie durch Dreimalwaschen mit PBS.
Verwenden Sie sterile Schere, um das ECM in 100 Milligramm Fragmente zu schneiden. Legen Sie jedes Fragment in einen Brunnen einer 24-Well-Platte und bebrüten Sie die Platte bei 25 Grad Celsius für 15 Minuten, damit überschüssige PBS aus den Fragmenten extrudieren können. Dann entfernen Sie vorsichtig alle übrig gebliebenen PBS aus den Brunnen mit einer Pipette.
Samen Jedes Fragment mit 20 Mikroliter Prereadipozyten-Zellsuspension durch Pipettieren der Zellen direkt in das ECM. Legen Sie die Pipettenspitze in das ECM und schieben Sie sie vorsichtig in die Mitte der Matrix, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension nicht überläuft und am Boden des Brunnens endet. Wenn die Zellsuspension aus dem ECM überläuft, entfernen Sie die Pipettenspitze von dieser Position und legen Sie sie an eine andere Stelle im ECM ein.
Nach der Zellaussaat das ECM 40 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Füllen Sie jeden Brunnen mit 500 Mikroliter Wachstumsmedien, um die gesäten ECM-Fragmente abzudecken. Kultur die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 72 Stunden.
Nach 72 Stunden die Wachstumsmedien sorgfältig ansaugen, ohne das ECM-Fragment zu stören. Fügen Sie 500 Mikroliter Differenzierungsmedien hinzu und kulturieren Sie die Zellen für 14 Tage, die alle zwei bis drei Tage die Medien wechseln. Prüfen Sie die Differenzierung mit der Lichtmikroskopie.
Zellen akkumulieren Lipide, färben sich braun-gelb und werden sphärischer, wenn sie sich differenzieren. Die Vorbereitung des Fettgewebes ECM, die Aussaat mit Präsipozyten und die In-vitro-Differenzierung in reife Adipozyten wurde mit Rasterelektronenmikroskopie überwacht, die eine Dezellularisierung des ECM und eine anschließende Rekapitulation von Lipiden, die Adipozyten enthalten, bei Reseeding und Differenzierung ergab. Kollagen 1 spezifische Immunhistochemie des dezellularisierten ECM zeigte die Aufrechterhaltung der Kollagen-Mikroarchitektur, während Oil Red-O Färbung von lebenden und festen 3D ECM-Adipozyten-Konstrukten Lipide zeigte, die Adipozyten enthielten.
Die im ECM differenzierten Adipozyten wurden auf adipogene Gene mit quantitativer Echtzeit-PCR untersucht, die zeigten, dass diese Gene in den differenzierten Zellen im Vergleich zu undifferenzierten Präadiipozyten, die im ECM kultiviert wurden, hochreguliert sind. Der vollständige Unterschied in den Transkriptsebenen wird angezeigt. Vier Kombinationen von ECM und Adipozyten von diabetischen und nichtdiabetischen Probanden wurden metabolischer Phänotypisierung unterzogen.
Beeinträchtigte Glukoseaufnahme in der lipolytischen Funktion wurde in Konstrukten aus diabetischen Geweben entdeckt. Wichtig ist, dass nichtdiabetische ECM insulinstimulierte Glukoseaufnahme und lipolytische Kapazität bei diabetischen Adipozyten rettet. Eine Kontamination der isolierten Präpozyten, des dezellularisierten Gewebes und des wiedersaatierten ECM ist keine Seltenheit.
Sterilität muss während des gesamten Protokolls sorgfältig aufrechterhalten werden.
