La hibridación in situ de montaje completo, WISH, proporciona una alta resolución y un resultado de fondo bajo en comparación con los métodos tradicionales. Además, las placas de deslizamiento en U mejoran el enfoque en la misma distancia focal mediante el uso de menos WISH se puede aplicar a embriones de ratón, embriones Drosophila y otros tejidos difíciles de manejar. El ensayo de formación de tubos se puede aplicar a células andrógenos diferenciadas con células madre.
WISH facilita la comprensión del significado funcional de la corrección de mutaciones. La persona que demostrará el procedimiento es Yong Wang, un asistente de investigación de mi laboratorio. Trabajando bajo un microscopio, utilice el sistema FemtoJet para inyectar dos nanogramos de Morpholinos y 500 picogramos de MRNA en embriones unicelulares.
Practique la microinyección de Morpholinos muchas veces hasta que pueda inyectarlo en las células con éxito y mantener la integridad de los huevos. Incubar los cigotos hasta que se descorionen y alcancen el estado de desarrollo que corresponde al experimento previsto. Como se describe en la tabla uno del manuscrito.
A continuación, utilice una pipeta de plástico para transferir de 20 a 40 embriones a un tubo de 1,5 mililitros. Añadir un mililitro de solución 4%PFA recién preparada a temperatura ambiente. Después de fijar, lavar y deshidratar los embriones como se describe en el manuscrito, coloque los embriones en un tamiz con malla de nylon en la parte inferior.
Hidratar los embriones lavándolos secuencialmente en 75%50% y 25%metanol durante cinco minutos cada uno. Después de lavar los embriones con PBST, agregue 50 microlitros de proteinasa K en el tubo con los embriones. Después de la digestión, retire la proteinasa K y lave los embriones con PBST tres veces durante cinco minutos cada vez.
Agregue de 50 a 100 microlitros de sondas diana mixtas en cada tubo con los embriones. Incubar los embriones durante la noche a 40 grados centígrados. Después de lavar los embriones como se describe en el manuscrito, utilice 4%paraformaldehído para fijar los embriones durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, lave los embriones en 2x solución SSCT tres veces durante 15 minutos cada vez a temperatura ambiente. Retire la solución SSCT y sustitúyalo por 50 microlitros de Amp 1. Luego incuba los embriones a 40 grados centígrados.
Después de 30 minutos, lave los embriones en 2x solución SSCT tres veces durante 15 minutos cada vez a temperatura ambiente. Retire la solución SSCT y añada 50 microlitros de Amp 2. Después de incubar durante 15 minutos y lavar el embrión como se hizo anteriormente, agregue 50 microlitros de Amp 3 y toque el tubo suavemente.
Incubar los embriones a 40 grados centígrados. Después de 30 minutos, lave los embriones como se describió anteriormente. A continuación, agregue 50 microlitros de Amp 4 dropwise y toque cuidadosamente el tubo.
Luego incuba los embriones a 40 grados Celsius durante 15 minutos y lávalos tres veces con SSCT. Después de preparar los embriones para la toma de imágenes como se describe en el manuscrito, utilice un kit de sustrato de peroxidasa DAB para manchar la muestra. Agregue 50 microlitros cada uno de los reactivos de color A, B y C a un mililitro de agua destilada.
Y mezcle bien para obtener un fluido de trabajo DAB completo. Agregue el líquido a la muestra y cúbralo durante diez minutos. Después de lavar a fondo las muestras, utilice un microscopio óptico para tomar imágenes de ellas.
Para comenzar a cultivar y controlar los iPSC DE HHT, agregue la matriz de membrana del sótano a seis placas de cultivo celular de pozos para cubrir la parte inferior de los pozos. Incubar las placas durante una hora a 37 grados centígrados. A continuación, retire la solución de matriz de membrana de sótano usada de los pozos, y agregue dos mililitros de mTeSR 1 medio en cada pozo.
Luego platue los iPSC cosechados del último pasaje en aproximadamente una vez diez a las seis células por pozo. Después de cultivar los iPSC durante aproximadamente cuatro días, cambie el medio de cultivo celular con el medio BEL suplementado. Crecer las células durante tres días para generar células mesoderm.
Para expandir las células endoteliales vasculares, reemplace el medio por un medio BEL suplementado durante cuatro días. Y luego tratar las células con el mismo medio y cultivo durante otros tres a cuatro días. Purificar las células endoteliales vasculares maduras utilizando Dinocávas CD31 de acuerdo con las instrucciones del kit.
A continuación, recoja las células positivas CD31 por búfer de elución. Mantener y ampliar las células endoteliales purificadas en medio EC-SFM que contiene VEGF165, bFGF y FBS. Para placar las células endoteliales, comience agregando 10 microlitros de matriz de membrana sótano por pozo a las placas de angiogénesis.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Cosechar las células endoteliales y resuspenderlas en medio de crecimiento endotelial 2 pipeteando repetidamente. Añadir 50 microlitros de esta suspensión celular a la matriz solidificada en cada pozo y luego incubar las células a 37 grados Celsius.
Después de tres a cinco horas de incubación, utilice un microscopio de alta resolución para evaluar la formación de tubos endoteliales. Captura imágenes de al menos diez áreas para cada grupo. Inspeccione la longitud total del tubo, el número de tubo y los puntos de rama.
CISH y WISH se realizaron para determinar la expresión de endoglina en embriones post-fertilización las 24 horas. Se utilizó un marcador endotelial hemogénico y un marcador de progenitor endotelial para examinar el efecto del silenciamiento de la endoglina. Las flechas rojas indican regiones donde la expresión de estos marcadores, aplnrna y npr1a, disminuyó significativamente.
El ensayo de formación de tubos endoteliales se realizó en el mutante de endoglin y controló las células endoteliales derivadas de iPSC. La formación del tubo fue evaluada y fotografiada después de tres horas. La longitud del tubo, el número de tubo y la ramificación se cuantificaron utilizando el software ImageJ.
Las células endoteliales mutantes formaron menos ramas que las células endoteliales de control. Y las ramas en las células endoteliales mutadas aumentaron significativamente después de la estimulación con factor de crecimiento endotelial vascular. Este método también se puede utilizar para la generación de iPS a partir de sangre periférica.
Y por el método aclara el papel de endocrino en la formación vascular in vitro e in vivo. Sabiendo que corregir la mutación puede marcar una diferencia en la angiogénesis, es posible trasplantar las células de nuevo a los pacientes para una posible terapia con células madre.
