Los RT-PCR convencionales no permiten la discriminación entre las secuencias de sentido y anti-sentido cuando se utilizan para detectar ARN codificados por genes superpuestos. Este protocolo permite detectar ARN específicamente antien sentido. El uso de imprimaciones biotiliadas junto con altas temperaturas de desnaturalización del ARN permite la amplificación de los ARN antientales, evitando la formación de productos RT no específicos.
Hemos utilizado este método para demostrar que ASP ya sea como un ARN anti-sentido o un precursor de proteínas, es un nuevo antígeno vih, lo hace potencialmente un nuevo objetivo de VIH para la terapia. Este método se puede aplicar a cualquier sistema, en el que se pueden detectar ARN antien sentido de genes superpuestos. Comience diseñando imprimaciones específicas para pacientes utilizando la secuencia de ADN pro-viral interna de las imprimaciones PanASP.
A continuación, cuantifique el ARN y elimine la contaminación del ADN mediante el tratamiento de muestras con DNase. Transfiera entre 0,1 y un microgramo de ARN total a los pozos apropiados en una placa PCR de 96 pozos. A continuación, configure la transcripción inversa, o reacción RT, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Prepare los controles RT endógenos añadiendo cinco microlitros de agua libre de nucleasas en lugar de la imprimación inversa ASP. Ponga la placa en el termociclador y caliente el ARN a 94 grados Celsius durante cinco minutos. A continuación, refrésquelo inmediatamente en agua helada durante al menos un minuto.
Preparar la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 mililitros como se describe en el manuscrito de texto, luego transferir 17,5 microlitros a cada uno de los pozos que contienen ARN. La desnaturalización del ARN debe realizarse a 94 grados centígrados. Sin desnaturalización total, pueden producirse síntesis de productos no específicos a partir del ARN de detección, lo que conduce a la amplificación de los ARN no específicos.
Mezclar el contenido de los pozos suavemente e incubar la placa a 55 grados Celsius durante 60 minutos. Luego, inactivar las reacciones calentando la placa a 70 grados Celsius durante 15 minutos. Prepare un litro de tampón de lavado y encuadernación 2X de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y filtre la solución.
A continuación, prepare 50 mililitros de tampón de lavado y unión 1X con agua de grado PCR. Transfiera el número adecuado de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina a un tubo de 1,5 mililitros y lávelos añadiendo un volumen igual de tampón de lavado y unión 2X y vórtice el tubo durante 15 segundos. Coloque el tubo en un bastidor de separación magnética e in incubarlo durante tres minutos a temperatura ambiente.
A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar las perlas y agregue el mismo volumen del tampón de lavado y unión 2X que el volumen inicial de las perlas. Vórtice las perlas durante 30 segundos y transfiera 10 microlitros de la suspensión a un número adecuado de tubos de 1,5 mililitros. Coloque los tubos en el bastidor de separación magnética e incubarlos durante tres minutos a temperatura ambiente.
A continuación, deseche el sobrenadante y agregue 50 microlitros de tampón de lavado y unión 2X. Añadir 50 microlitros de ADNc biotilatada a los tubos correspondientes con las perlas e incubarlos durante 30 minutos mientras gira suavemente. Después de la incubación, coloque los tubos en el bastidor de separación magnética durante tres minutos y luego lave las perlas con 200 microlitros de tampón de lavado y unión 1X, seguido de una incubación de tres minutos en el bastidor de separación.
Deseche el sobrenadante y repita el lavado dos veces. Luego, resuspender las cuentas en 10 microlitros de agua de grado PCR. Preparar un volumen apropiado de PCR Master Mix de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Mezclar bien y girar rápidamente hacia abajo, a continuación, transferir 49 microlitros por pozo a una placa PCR de 96 pozos. Atrafirque cuidadosamente los tubos con el ADNc purificado durante 15 segundos y añada un microlitro de la suspensión a los pozos correspondientes. Ejecute el PCR y separe los productos en un gel de 1% de agarosa.
Cortar las bandas del gel y clonar los productos amplificados en un plásmido PCR 2.1. A continuación, secuencia los clones y analiza cada secuencia. Las reacciones RT iniciales se realizaron con la imprimación antien sentido regular no biotilada y dieron lugar a una amplificación exitosa de ASP.
Sin embargo, también se amplificó una banda con el mismo peso molecular y controles de imprimación menos. Para evitar este problema, la imprimación antien sentido específica fue etiquetada con biotón y el ADNn anti-detección resultante fue purificado antes de PCR. Esto hizo posible amplificar la secuencia ASP con una contaminación muy reducida del ADNc no específico en los controles de imprimación menos.
La optimización adicional de este método se logró mediante la desnaturalización completa del ARN a 94 grados centígrados antes de RT, seguido de un enfriamiento inmediato en el agua helada, lo que dio lugar a una amplificación efectiva de la banda ASP y no hay productos no específicos. Se midió la cinética del ARN ASP y se aislaron las células CD4 de tres sujetos VIH positivos con viremia detectable y la ausencia de terapia tras la estimulación con anti-CD3/CD28. La cuantificación del ARN ASP también fue posible en pacientes sometidos a TAR, con viremia no detectable.
En dos de cada tres pacientes, el ARN ASP se detectó en niveles bajos a los tres a cinco días después de la estimulación. Se analizaron dos pacientes para ASP y ENv RNAs, uno sin tratar y otro tratado. Para el paciente no tratado, ambos ARN podrían ser detectados.
Para el paciente tratado, ASP y env fueron apenas detectables después de varios días de estimulación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la desnaturalización linealiza el ARN para que se destruyan las estructuras secundarias capaces de primar rt. Mientras que, el lavado de las cuentas elimina los cDNAs no biotilidades.
Después de la purificación de los cDNAs con la polaridad correcta, qPCR se puede realizar para analizar la expresión génica. Además, los cDNAs también se pueden clonar y utilizar para el análisis de secuencias. Este método permite estudiar genes superpuestos en orientación opuesta y puede ser útil para dilucidar la regulación y la patogénesis de una bacteria y una enfermedad relacionada con el virus, incluidos algunos tipos de cáncer.
