Los modelos actuales de enfermedades para la pérdida de células endoteliales corneales se centran en la destrucción del endotelio y más probablemente representan las etapas finales de la enfermedad cuando el trasplante de córnea es inevitable. Sin embargo, ahora están disponibles nuevos tratamientos con células madre o terapia génica que podrían ser más útiles para las primeras etapas de la enfermedad, cuyos modelos faltan. La cirugía intraocular no invasiva por fotodisrupción con un láser Nd:YAG se ha convertido en un procedimiento de rutina para los oftalmólogos.
Después de obtener los ojos de cerdo recién enucleados del matadero local, coloque las muestras en cuatro grados Celsius medio completo. Use tijeras para extraer los tejidos extracelulares y remojar los ojos en una solución oftálmica de yodo 5%povidona durante cinco minutos. A continuación, coloque las muestras desinfectadas en PBS estériles a temperatura ambiente.
Usando un dispositivo de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, examina los ojos para detectar las principales patologías del segmento anterior, como cicatrices corneales, edema y otras opacidades. Después del cribado, coloque los ojos delante de una unidad de lámpara deslizante equipada con un láser Nd:YAG con una longitud de onda de 1.064 nanómetros y un diámetro de punto focal de 10 micrómetros en el aire. Seleccione el aumento 12X y desvíe la iluminación para visualizar las capas corneales individuales.
Después de establecer la energía del pulso y el punto de enfoque a los parámetros apropiados para la ablación selectiva de las células endoteliales corneales, aplique varias tomas láser en el tejido. Luego, bajo un microscopio diseccionado, coloque una paracentesis clara de córnea cerca del limbo e inyecte viscoelástico para estabilizar la cámara anterior. A continuación, utilice una tretina de ocho milímetros para extirpar la córnea central tratada con láser y coloque la córnea aislada en un pozo de un lado endotelial de placa de 12 pozos hacia arriba.
Una vez recolectadas todas las córneas, añada tres milímetros de medio completo a cada muestra e incubar los especímenes durante hasta tres días a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, reemplace el medio en cada pozo por 4%paraformaldehído libre de metanol en el tampón de Sorensen para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque las muestras fijas en 20% sacarosa en PBS durante aproximadamente una hora hasta que las córneas se hundan.
Transfiera las muestras a una sacarosa al 30% en PBS durante la noche antes de incrustar los tejidos a una temperatura de corte óptima para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Utilice un criostato establecido en menos 27 grados Celsius para obtener secciones de 10 micrómetros de espesor de los tejidos congelados que recogen cada sección en una diapositiva del microscopio dentro de un minuto después de que se adquiera. A continuación, guarde los portaobjetos a menos 80 grados centígrados hasta que se manche.
Para la tinción de hematoxilina y eosina, seque al aire las secciones congeladas durante varios minutos para eliminar la humedad antes de mancharlas con hematoxilina filtrada de 0,1% de Mayer durante 10 minutos en un tubo de 50 mililitros. Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos en agua doble destilada durante cinco minutos en una cubeta. A continuación, sumerja los toboganes en 0,5%eosina 10 veces, seguido de enjuagar en agua doble destilada hasta que la eosina deje de rayar.
Sumerja los portaobjetos enjuagados 10 veces en 50%etanol y 10 veces en 70%etanol. Después de la última caída de 70%etanol, equilibre las secciones en 95%etanol durante 30 segundos, seguido de 60 segundos en 100%etanol antes de varias caídas en xileno. A continuación, monte las muestras con cubreobjetos antes de obtener imágenes en un microscopio de luz.
Dos imágenes de microscopía de fotón y luz deben evaluarse de forma independiente como sin daños, demasiado daño o cantidad correcta de daño. Sobre la base de estas evaluaciones, se puede calcular un mapa de calor para seleccionar la constelación correcta de parámetros láser para la ablación selectiva de las células endoteliales corneales con un daño mínimo al tejido circundante. El análisis previo ha determinado que el punto focal del láser debe estar al menos 0,15 milímetros detrás del endotelio corneal para la energía de pulso más baja probada.
Para las energías de pulso superiores a 2,9 milioules, la distancia focal más larga probada sigue siendo demasiado cercana al endotelio. Varios agentes citoprotectores pueden ser probados mientras los especímenes extirpados están en cultivo. Si se demuestra que tienen éxito, se pueden añadir a la solución de riego para el tratamiento.
