Damos las gracias a Kristin Johnson para la obra gráfica.

Todos los protocolos que involucran animales son presentados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Hospital de Niños de Boston y se llevan a cabo de conformidad con las recomendaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). Asegúrese de utilizar instrumentos estériles y techniqure aséptica mientras realiza el procedimiento. 1 Preparación de Pellets <ol><li> Pesar 10 mg de sucralfato y 60 mg de Hydron con la espátula estéril sin doblar. Coloque en tubos de microcentrífuga separados. </li><li> Coloque un pedazo cuadrado de 1 cm de malla en una placa de 10 cm estéril. Invertir de manera malla descansa sobre la tapa superficial. Ponga a un lado. </li><li> Añadir 500 l de etanol a la Hydron y agitar durante al menos 10 min. </li><li> Añadir la cantidad apropiada de factor de crecimiento (estándar: 20 g de bFGF, 50 g de VEGF) a la sucralfato y agitar brevemente. Factor de crecimiento en una tienda-80 ° C congelador a una concentración de 1 mg / ml. Los volúmenes líquidos agregados deben tener un mínimo de 20 l para asegurar el sucralfato está completamente humedecido, pero no deben exceder de 50 l. Mayor volumen hace que la evaporación del líquido en la siguiente etapa difícil. </li><li> Colocar la mezcla de sucralfato en el evaporador centrífugo de implantación baja hasta que la mezcla esté completamente seco, normalmente 30-50 min dependiendo del volumen de líquido utilizado. <ol><li> Compruebe la mezcla para la humedad residual con el extremo cónico de una espátula estéril. La mezcla debe sentirse &quot;crujiente&quot;. </li></ol></li><li> Con la punta afilada de la espátula para romper la mezcla sucralfato dentro del tubo. </li><li> Añadir 10 l de la hydron al sucralfato. <ol><li> Debido a la naturaleza viscosa de Hydron, cortar el extremo de una punta de pipeta 200 l y luego dibujar y liberar los 10 l antes de la pipeta hacia arriba otra vez y añadiendo al sucralfato. </li></ol></li><li> Utilizar rápidamente escupió dobladaula para mezclar la hydron y sucralfato y retirar de tubo. <ol><li> Reunir la mezcla a lo largo de la parte inferior de la punta de la espátula doblada y luego girar el tubo mientras el dibujo de la espátula a lo largo de la pared del tubo. La mezcla se seca rápidamente lo que este paso se debe realizar de manera eficiente. </li></ol></li><li> Extienda la mezcla sobre la malla preparada utilizando pinzas para mantenerlo en su lugar. La mezcla debe ser una capa uniforme y llenar en los agujeros de la malla. </li><li> Sumerja la espátula doblada en el tubo que contiene hydron y utilizarlo cubrir ambos lados de la malla. </li><li> Coloque la malla recubierta apoyado en parte contra el borde del plato y dejar secar a temperatura ambiente durante 30 a 45 min. </li><li> Coloque la malla de -20 ° C congelador o proceder inmediatamente al siguiente paso. Mantenga malla dentro del plato. </li><li> Coloque el plato de 35 mm en el interior de la placa de Petri grande, tapa. Utilice el par de pinzas para tirar cuidadosamente las fibras de la malla aparte sobre el plato 35 mm. Bolitas de Stray cun ser recogidos desde el plato más grande al final. <ol><li> Compruebe pellets para la uniformidad en el alcance. El proceso rinde aproximadamente 250 pastillas por lo tanto la dosis estándar por pastilla para bFGF y VEGF es 80 ng y 200 ng, respectivamente. </li></ol></li><li> Bolitas en tienda a 35 mm plato en -20 ° C congelador hasta 3 meses. </li></ol> 2. implantación quirúrgica de Pellets <ol><li> Establezca un área quirúrgica bajo microscopio quirúrgico. </li><li> Anestesiar al ratón con Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal) y coloque el ratón bajo el microscopio de modo ojo es visible. Realizar pizca dedo del pie para asegurar un nivel suficiente de la anestesia. </li><li> Anestesiar el ojo del ratón colocando 1 gota de solución proparacaina lo alto del globo ocular. Espere 20-30 segundos y quite con una gasa. </li><li> Proptose el ojo del ratón con el # 1 embotado joyeros fórceps siendo cierto para dejar la piel entre los fórceps y los ojos. Es importante para juzgar la presión aplicada correctamente.60; La celebración de la vista con demasiada firmeza hará que se ponga roja e irritada, mientras que también perderá una bodega permitirá ojo se mueva durante la cirugía. </li><li> Utilice la microknife 30 ° para hacer una incisión en la córnea de aproximadamente 1 mm desde el limbo. La incisión debe ser de 1-2 mm de longitud. Incisión debe ser lo suficientemente profundo para penetrar más allá de la capa epitelial en midstroma pero no tan profundo como para romper el ojo. </li><li> Utilice el cuchillo von Graef para hacer un bolsillo perpendicular a la incisión. <ol><li> Deslizar el cuchillo debajo de la capa córnea en el sitio de la incisión y trabajar suavemente cuchillo en y moverlo a lo largo de la incisión para agrandar el espacio, formando así el bolsillo. Esto ayuda a mover el ratón así como para ser capaz de trabajar con la curvatura del ojo. Tenga cuidado de no empujar hacia abajo con la punta para evitar la ruptura del ojo. </li></ol></li><li> Moje fórceps el # 5 de joyero con proparacaína y elegir un pellet subir de plato. Colocar un pellet en el ojo. </li&gt; <li> Humedezca el cuchillo von Graef con proparacaína y transferir algunas de líquido sobre pellet para que sea gomoso y flexible. Retire el exceso de humedad con una gasa o un hisopo de algodón. </li><li> Inserte la pastilla en el bolsillo con el cuchillo von Graef para empujarlo dentro de debajo de la capa córnea. Una vez que todo el sedimento que hay dentro, desliza la parte plana del cuchillo von Graef más sitio para comprobar que la pastilla es segura. </li><li> Cubra el ojo con un ungüento antibiótico triple. </li><li> Ponga el ratón y repetir la cirugía en el ojo opuesto. </li></ol> 3. Cuantificación de neovascularización corneal. Deje a los animales para desarrollar vasos durante un período determinado de tiempo. El día de la clasificación recipiente depende del factor de crecimiento utilizado. Grado bFGF en el día 5 y el VEGF más débil en el día 6. El día de la implantación es el día 0. <ol><li> Anestesiar el ratón con avertina (400-500 mg / kg, intraperitoneal). </li><li> Utilice el microscopio de lámpara de hendidura para grading. Un ocular tiene una retícula, líneas dentro del ocular utilizado como una ayuda de medición para cuantificar la eslora del buque y la distancia alrededor de la circunferencia del ojo que los buques han brotado. <ol><li> Mantenga el ratón delante de alcance, posicionando el ratón de modo ojo se ve en ocular con pellet directamente por delante. Estabilizar la cabeza entre el pulgar y el dedo índice para que la piel se tensa en la cara y el ojo es ligeramente proptosed. </li></ol></li><li> Coloque el eje y de la retícula a lo largo del recipiente de limbal directamente debajo de pellets. Medir la longitud de los vasos de ramificación hacia arriba, hacia pellets. Registre esta medición en décimas de milímetros y designar a la eslora del buque (VL) (Figura 1A). </li><li> Gire el ratón o el bolso para que la distancia alrededor del ojo que estos buques han brotado se aclara. Es más fácil pensar en el ojo como un reloj con intervalos de 1 a 12 horas Designar este número reloj (CH) (Figura 1B). Puede ser un número entero o fracciones de 0,25 (por ejemplo, 2, 2,25, 2,5 o 2,75). Nota: CH es subjetiva. Por ejemplo, algunos pueden medir la distancia alrededor del ojo para incluir todos los buques germinados desde el limbo mientras que otros pueden detener la medición en el punto donde la eslora del buque es la mitad del máximo. El factor importante es ser coherente con la forma en que uno elige a grado. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> Figura 1. Cuantificación de la neovascularización corneal. (A) 80 ng de bFGF sedimento implantado en ratones C57BL / 6J muestra retícula lámpara de hendidura orientada para medir la longitud del vaso. VL = 0,9 mm. (B) La misma muestra el ojo con lámpara de hendidura retícula gira para medir hora de reloj. CH = 3.25. Área del vaso Calculado = 1,84 mm 2. Estas imágenes han sido mejoradas digitalmente para permitir la adición de esquemática retícula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <ol start="5"><li> Calcular el área del vaso (VA) utilizando la siguiente fórmula, que se basa en el área de un óvalo (Nota, es útil tener esto en cuenta a la hora de clasificación.) Expreso VA en milímetros cuadrados. La fórmula es como sigue: Vessel longitud x Reloj hora x 0,2 π = área del vaso </li></ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios pasos críticos en la realización de un exitoso ensayo de la córnea. El primero es hacer gránulos uniformes capaces de ser implantado y la estimulación de los vasos. Las partes más importantes de la preparación de pellets son: 1) el uso del factor de crecimiento sin vehículo; 2) garantizar una buena mezcla de factores de crecimiento con el sucralfato y hydron y 3) que se mueve la mezcla final con rapidez pero con cuidado del tubo Eppendorf a la malla donde se echan los pellets. Se recomienda que los pe...

El proceso de angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos se forman los preexistentes, es muy complejo y está regulado por varios factores endógenos que controlan diferentes etapas de germinación recipiente y la morfogénesis. La angiogénesis se activa debido a un cambio en el equilibrio entre los factores pro-y anti-angiogénicos, un equilibrio que mantiene normalmente la vasculatura en un estado de reposo. La angiogénesis en adultos se produce en ciertas condiciones fisiológicas, tales como durante el ciclo ovárico femenino o en los procesos de reparación, tales como la curación de heridas y regeneración de tejidos. Sin embargo, también es una característica de varias patologías, incluyendo tumores malignos, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias. La participación de la angiogénesis en estas condiciones fisiológicas y patológicas hace que sea un tema importante para la investigación y un blanco atractivo para la terapia. Debido a la complejidad de la angiogénesis y la participación de varios cells y factores en el proceso, incluyendo las células endoteliales, pericitos, células circulantes y las células del estroma, in vitro modelos siguen siendo limitados y no pueden recapitular el microambiente único en vivo. La principal ensayos in vitro de la angiogénesis se centran en gran medida en la observación de efectos directos sobre las células endoteliales y la medición de ciertas medidas en proceso angiogénico en condiciones controladas. Estos ensayos incluyen la cuantificación de la proliferación celular endotelial 1, la migración 2, la formación de la red 3, la formación del tubo 4 y la brotación de esferoides 5. Modelos ex vivo, a diferencia de los in vitro, son más complejos e incorporar múltiples tipos de células de tejidos, siendo un ejemplo el ensayo de anillo aórtico 6. Sin embargo, como otros sistemas, no puede capturar la contribución de las células circulantes y el estroma natural de las células endoteliales como existe in vivo. Los intentospara estudiar la angiogénesis bajo flujo para imitar el entorno in vivo se llevan a cabo utilizando sistemas de microfluidos 7, sin embargo, incluso estos ensayos, aunque ha mejorado mucho, todavía son incapaces de dar cuenta de todos los compartimentos existentes en vivo. Debido a las limitaciones de la ex vivo modelos de angiogénesis in vitro y en modelos in vivo siguen siendo las opciones más fiables para los estudios de la angiogénesis. Ejemplos de estos modelos incluyen la implantación de cámaras transparentes, &quot;Windows&quot;, que permiten la visualización de los vasos sanguíneos que crecen bajo microscopio de 8, implantes subcutáneos inyectables tales como matrigel y recipiente de formación en tejidos normales tales como oreja de ratón y la membrana corioalantoidea de pollo (CAM ). Sin embargo, uno de los modelos de angiogénesis in vivo más aceptables y cuantitativos es el ensayo de neovascularización corneal microbolsa se ​​describe aquí, que aprovecha la natural avascularcórnea como una &quot;pantalla&quot; para visualizar y evaluar el nuevo crecimiento angiogénico 9. Aquí se describe el ensayo de microbolsa corneal como desarrollado en ratones. Inicialmente, el modelo se utilizó para medir los estímulos angiogénicos no específicos en córneas de conejo. Esto se hizo mediante la introducción de piezas de tumor en el humor acuoso de la cámara anterior del ojo del conejo y se mide la neovascularización inducida por tumor 11. Sin embargo, el ensayo se desarrolló más tarde para estudiar los efectos de factores de crecimiento específico 10 para especificar y estandarizar el efecto angiogénico mejor. Con el fin de liberar el factor de crecimiento en el ojo, se usaron gránulos de liberación lenta que contienen cantidades conocidas de los factores de crecimiento angiogénicos en lugar de tejidos. La disponibilidad de proteínas recombinantes purificadas angiogénicos tales como bFGF o VEGF activar su uso como objetivos específicos de la angiogénesis modulaters 12. Inicialmente, el ensayo seutilizado en gran medida en los conejos, que son más fáciles de trabajar debido a su tamaño, pero más tarde el modelo fue traducido en ratones; un modelo animal más pequeño y menos caro. El cambio de conejo a ratones proporcionan una importante ventaja de ser capaz de utilizar animales manipulados genéticamente, creando así una nueva área de investigación sobre los componentes genéticos que afectan la angiogénesis 13. Además del uso más aceptable de ensayo de la córnea en el estudio de la angiogénesis, otros procesos biológicos también pueden ser investigados utilizando ensayos modificados. Por ejemplo, se realizaron estudios de linfangiogénesis posible a través de la implantación de gránulos de bajas dosis de bFGF que permitieron la visualización de los vasos linfáticos a través de marcadores moleculares específicos 14. Además, este ensayo ha proporcionado un medio para evaluar los efectos de la radiación sobre la angiogénesis 15. En resumen, el ensayo de angiogénesis microbolsa corneal es una cuantitativa, reproducible, evaluación flexible de la angiogénesis in vivo. Una ventaja importante de este ensayo es que la medición de los buques de fondo es innecesaria porque los vasos crecen en un tejido avascular naturalmente. Se describe aquí el protocolo de este ensayo en los detalles y discutir diferentes escenarios que pueden ocurrir. El ensayo consta de 3 segmentos discretos. Aquí vamos a describir la preparación de gránulos de factor de crecimiento incluido, la implantación quirúrgica posterior y, finalmente, el método utilizado para cuantificar el crecimiento neovascular resultante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

El ensayo de microbolsa de córnea de ratón es un ensayo robusto y cuantitativa in vivo para la evaluación de la angiogénesis. Mediante el uso de gránulos de liberación lenta estandarizadas que contienen factores de crecimiento específicos que activan el crecimiento de vasos sanguíneos a lo largo de la córnea avascular, naturalmente, la angiogénesis puede medirse y cuantificarse. En este ensayo se genera la respuesta angiogénica en el transcurso de varios días, dependiendo del tipo y la dosis del factor de crecimiento utilizado. La inducción de neovascularización son generalmente accionadas por cualquiera de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Mediante la combinación de estos factores de crecimiento con sucralfato y Hydron (poli-HEMA (poli (metacrilato de 2-hidroxietilo))) y la mezcla de fundición en forma de gránulos, que pueden ser implantados quirúrgicamente en el ojo del ratón. Estos gránulos uniformes lentamente a la liberación Los factores de crecimiento durante cinco o seis días (bFGF o VEGF, respectivamente) que permite suficiente respuesta angiogénica requerido para el área del vaso quantification usando una lámpara de hendidura. Este ensayo se puede utilizar para diferentes aplicaciones, incluyendo la evaluación de medicamentos o tratamientos moduladores angiogénicos así como la comparación entre los diferentes fondos genéticos que afectan a la angiogénesis. Un investigador experto después de practicar este ensayo puede implantar un pellet en menos de 5 min por ojo.

Los resultados típicos para bFGF y VEGF pellets en los bajos angiogénicos C57BL / 6J normales se muestran en la Figura 2A y B, respectivamente. Figura 2E muestra la distribución normal de área del vaso (VA) en el / cepa C57BL 6J con dosis variables de estos crecimiento factores. 80 pelets de bFGF ng normalmente dan como resultado un VA de aproximadamente 2,0 mm 2, aunque los valores en una gama de 1.8 a 2.4 mm 2 son aceptables. 200 ng de VEGF g...

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The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

El protocolo describe el microensayo corneal como desarrollado en ratones.

El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.5K vistas.  Boston Children's Hospital.  El protocolo describe el microensayo corneal como desarrollado en ratones. 

Video: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Investigación

Neurociencias

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Un aplastamiento del nervio óptico Lesiones modelo murino para estudiar la supervivencia de células ganglionares retinianas

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

La detección de placas neuríticas en el modelo de la enfermedad de Alzheimer ratón

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Un método volumétrico para la cuantificación de vasoespasmo Cerebral en un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...