Damos las gracias a Kristin Johnson para la obra gráfica.

Todos los protocolos que involucran animales son presentados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Hospital de Niños de Boston y se llevan a cabo de conformidad con las recomendaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). Asegúrese de utilizar instrumentos estériles y techniqure aséptica mientras realiza el procedimiento. 1 Preparación de Pellets <ol><li> Pesar 10 mg de sucralfato y 60 mg de Hydron con la espátula estéril sin doblar. Coloque en tubos de microcentrífuga separados. </li><li> Coloque un pedazo cuadrado de 1 cm de malla en una placa de 10 cm estéril. Invertir de manera malla descansa sobre la tapa superficial. Ponga a un lado. </li><li> Añadir 500 l de etanol a la Hydron y agitar durante al menos 10 min. </li><li> Añadir la cantidad apropiada de factor de crecimiento (estándar: 20 g de bFGF, 50 g de VEGF) a la sucralfato y agitar brevemente. Factor de crecimiento en una tienda-80 ° C congelador a una concentración de 1 mg / ml. Los volúmenes líquidos agregados deben tener un mínimo de 20 l para asegurar el sucralfato está completamente humedecido, pero no deben exceder de 50 l. Mayor volumen hace que la evaporación del líquido en la siguiente etapa difícil. </li><li> Colocar la mezcla de sucralfato en el evaporador centrífugo de implantación baja hasta que la mezcla esté completamente seco, normalmente 30-50 min dependiendo del volumen de líquido utilizado. <ol><li> Compruebe la mezcla para la humedad residual con el extremo cónico de una espátula estéril. La mezcla debe sentirse &quot;crujiente&quot;. </li></ol></li><li> Con la punta afilada de la espátula para romper la mezcla sucralfato dentro del tubo. </li><li> Añadir 10 l de la hydron al sucralfato. <ol><li> Debido a la naturaleza viscosa de Hydron, cortar el extremo de una punta de pipeta 200 l y luego dibujar y liberar los 10 l antes de la pipeta hacia arriba otra vez y añadiendo al sucralfato. </li></ol></li><li> Utilizar rápidamente escupió dobladaula para mezclar la hydron y sucralfato y retirar de tubo. <ol><li> Reunir la mezcla a lo largo de la parte inferior de la punta de la espátula doblada y luego girar el tubo mientras el dibujo de la espátula a lo largo de la pared del tubo. La mezcla se seca rápidamente lo que este paso se debe realizar de manera eficiente. </li></ol></li><li> Extienda la mezcla sobre la malla preparada utilizando pinzas para mantenerlo en su lugar. La mezcla debe ser una capa uniforme y llenar en los agujeros de la malla. </li><li> Sumerja la espátula doblada en el tubo que contiene hydron y utilizarlo cubrir ambos lados de la malla. </li><li> Coloque la malla recubierta apoyado en parte contra el borde del plato y dejar secar a temperatura ambiente durante 30 a 45 min. </li><li> Coloque la malla de -20 ° C congelador o proceder inmediatamente al siguiente paso. Mantenga malla dentro del plato. </li><li> Coloque el plato de 35 mm en el interior de la placa de Petri grande, tapa. Utilice el par de pinzas para tirar cuidadosamente las fibras de la malla aparte sobre el plato 35 mm. Bolitas de Stray cun ser recogidos desde el plato más grande al final. <ol><li> Compruebe pellets para la uniformidad en el alcance. El proceso rinde aproximadamente 250 pastillas por lo tanto la dosis estándar por pastilla para bFGF y VEGF es 80 ng y 200 ng, respectivamente. </li></ol></li><li> Bolitas en tienda a 35 mm plato en -20 ° C congelador hasta 3 meses. </li></ol> 2. implantación quirúrgica de Pellets <ol><li> Establezca un área quirúrgica bajo microscopio quirúrgico. </li><li> Anestesiar al ratón con Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal) y coloque el ratón bajo el microscopio de modo ojo es visible. Realizar pizca dedo del pie para asegurar un nivel suficiente de la anestesia. </li><li> Anestesiar el ojo del ratón colocando 1 gota de solución proparacaina lo alto del globo ocular. Espere 20-30 segundos y quite con una gasa. </li><li> Proptose el ojo del ratón con el # 1 embotado joyeros fórceps siendo cierto para dejar la piel entre los fórceps y los ojos. Es importante para juzgar la presión aplicada correctamente.60; La celebración de la vista con demasiada firmeza hará que se ponga roja e irritada, mientras que también perderá una bodega permitirá ojo se mueva durante la cirugía. </li><li> Utilice la microknife 30 ° para hacer una incisión en la córnea de aproximadamente 1 mm desde el limbo. La incisión debe ser de 1-2 mm de longitud. Incisión debe ser lo suficientemente profundo para penetrar más allá de la capa epitelial en midstroma pero no tan profundo como para romper el ojo. </li><li> Utilice el cuchillo von Graef para hacer un bolsillo perpendicular a la incisión. <ol><li> Deslizar el cuchillo debajo de la capa córnea en el sitio de la incisión y trabajar suavemente cuchillo en y moverlo a lo largo de la incisión para agrandar el espacio, formando así el bolsillo. Esto ayuda a mover el ratón así como para ser capaz de trabajar con la curvatura del ojo. Tenga cuidado de no empujar hacia abajo con la punta para evitar la ruptura del ojo. </li></ol></li><li> Moje fórceps el # 5 de joyero con proparacaína y elegir un pellet subir de plato. Colocar un pellet en el ojo. </li&gt; <li> Humedezca el cuchillo von Graef con proparacaína y transferir algunas de líquido sobre pellet para que sea gomoso y flexible. Retire el exceso de humedad con una gasa o un hisopo de algodón. </li><li> Inserte la pastilla en el bolsillo con el cuchillo von Graef para empujarlo dentro de debajo de la capa córnea. Una vez que todo el sedimento que hay dentro, desliza la parte plana del cuchillo von Graef más sitio para comprobar que la pastilla es segura. </li><li> Cubra el ojo con un ungüento antibiótico triple. </li><li> Ponga el ratón y repetir la cirugía en el ojo opuesto. </li></ol> 3. Cuantificación de neovascularización corneal. Deje a los animales para desarrollar vasos durante un período determinado de tiempo. El día de la clasificación recipiente depende del factor de crecimiento utilizado. Grado bFGF en el día 5 y el VEGF más débil en el día 6. El día de la implantación es el día 0. <ol><li> Anestesiar el ratón con avertina (400-500 mg / kg, intraperitoneal). </li><li> Utilice el microscopio de lámpara de hendidura para grading. Un ocular tiene una retícula, líneas dentro del ocular utilizado como una ayuda de medición para cuantificar la eslora del buque y la distancia alrededor de la circunferencia del ojo que los buques han brotado. <ol><li> Mantenga el ratón delante de alcance, posicionando el ratón de modo ojo se ve en ocular con pellet directamente por delante. Estabilizar la cabeza entre el pulgar y el dedo índice para que la piel se tensa en la cara y el ojo es ligeramente proptosed. </li></ol></li><li> Coloque el eje y de la retícula a lo largo del recipiente de limbal directamente debajo de pellets. Medir la longitud de los vasos de ramificación hacia arriba, hacia pellets. Registre esta medición en décimas de milímetros y designar a la eslora del buque (VL) (Figura 1A). </li><li> Gire el ratón o el bolso para que la distancia alrededor del ojo que estos buques han brotado se aclara. Es más fácil pensar en el ojo como un reloj con intervalos de 1 a 12 horas Designar este número reloj (CH) (Figura 1B). Puede ser un número entero o fracciones de 0,25 (por ejemplo, 2, 2,25, 2,5 o 2,75). Nota: CH es subjetiva. Por ejemplo, algunos pueden medir la distancia alrededor del ojo para incluir todos los buques germinados desde el limbo mientras que otros pueden detener la medición en el punto donde la eslora del buque es la mitad del máximo. El factor importante es ser coherente con la forma en que uno elige a grado. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> Figura 1. Cuantificación de la neovascularización corneal. (A) 80 ng de bFGF sedimento implantado en ratones C57BL / 6J muestra retícula lámpara de hendidura orientada para medir la longitud del vaso. VL = 0,9 mm. (B) La misma muestra el ojo con lámpara de hendidura retícula gira para medir hora de reloj. CH = 3.25. Área del vaso Calculado = 1,84 mm 2. Estas imágenes han sido mejoradas digitalmente para permitir la adición de esquemática retícula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <ol start="5"><li> Calcular el área del vaso (VA) utilizando la siguiente fórmula, que se basa en el área de un óvalo (Nota, es útil tener esto en cuenta a la hora de clasificación.) Expreso VA en milímetros cuadrados. La fórmula es como sigue: Vessel longitud x Reloj hora x 0,2 π = área del vaso </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios pasos críticos en la realización de un exitoso ensayo de la córnea. El primero es hacer gránulos uniformes capaces de ser implantado y la estimulación de los vasos. Las partes más importantes de la preparación de pellets son: 1) el uso del factor de crecimiento sin vehículo; 2) garantizar una buena mezcla de factores de crecimiento con el sucralfato y hydron y 3) que se mueve la mezcla final con rapidez pero con cuidado del tubo Eppendorf a la malla donde se echan los pellets. Se recomienda que los pe...

El proceso de angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos se forman los preexistentes, es muy complejo y está regulado por varios factores endógenos que controlan diferentes etapas de germinación recipiente y la morfogénesis. La angiogénesis se activa debido a un cambio en el equilibrio entre los factores pro-y anti-angiogénicos, un equilibrio que mantiene normalmente la vasculatura en un estado de reposo. La angiogénesis en adultos se produce en ciertas condiciones fisiológicas, tales como durante el ciclo ovárico femenino o en los procesos de reparación, tales como la curación de heridas y regeneración de tejidos. Sin embargo, también es una característica de varias patologías, incluyendo tumores malignos, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias. La participación de la angiogénesis en estas condiciones fisiológicas y patológicas hace que sea un tema importante para la investigación y un blanco atractivo para la terapia. Debido a la complejidad de la angiogénesis y la participación de varios cells y factores en el proceso, incluyendo las células endoteliales, pericitos, células circulantes y las células del estroma, in vitro modelos siguen siendo limitados y no pueden recapitular el microambiente único en vivo. La principal ensayos in vitro de la angiogénesis se centran en gran medida en la observación de efectos directos sobre las células endoteliales y la medición de ciertas medidas en proceso angiogénico en condiciones controladas. Estos ensayos incluyen la cuantificación de la proliferación celular endotelial 1, la migración 2, la formación de la red 3, la formación del tubo 4 y la brotación de esferoides 5. Modelos ex vivo, a diferencia de los in vitro, son más complejos e incorporar múltiples tipos de células de tejidos, siendo un ejemplo el ensayo de anillo aórtico 6. Sin embargo, como otros sistemas, no puede capturar la contribución de las células circulantes y el estroma natural de las células endoteliales como existe in vivo. Los intentospara estudiar la angiogénesis bajo flujo para imitar el entorno in vivo se llevan a cabo utilizando sistemas de microfluidos 7, sin embargo, incluso estos ensayos, aunque ha mejorado mucho, todavía son incapaces de dar cuenta de todos los compartimentos existentes en vivo. Debido a las limitaciones de la ex vivo modelos de angiogénesis in vitro y en modelos in vivo siguen siendo las opciones más fiables para los estudios de la angiogénesis. Ejemplos de estos modelos incluyen la implantación de cámaras transparentes, &quot;Windows&quot;, que permiten la visualización de los vasos sanguíneos que crecen bajo microscopio de 8, implantes subcutáneos inyectables tales como matrigel y recipiente de formación en tejidos normales tales como oreja de ratón y la membrana corioalantoidea de pollo (CAM ). Sin embargo, uno de los modelos de angiogénesis in vivo más aceptables y cuantitativos es el ensayo de neovascularización corneal microbolsa se ​​describe aquí, que aprovecha la natural avascularcórnea como una &quot;pantalla&quot; para visualizar y evaluar el nuevo crecimiento angiogénico 9. Aquí se describe el ensayo de microbolsa corneal como desarrollado en ratones. Inicialmente, el modelo se utilizó para medir los estímulos angiogénicos no específicos en córneas de conejo. Esto se hizo mediante la introducción de piezas de tumor en el humor acuoso de la cámara anterior del ojo del conejo y se mide la neovascularización inducida por tumor 11. Sin embargo, el ensayo se desarrolló más tarde para estudiar los efectos de factores de crecimiento específico 10 para especificar y estandarizar el efecto angiogénico mejor. Con el fin de liberar el factor de crecimiento en el ojo, se usaron gránulos de liberación lenta que contienen cantidades conocidas de los factores de crecimiento angiogénicos en lugar de tejidos. La disponibilidad de proteínas recombinantes purificadas angiogénicos tales como bFGF o VEGF activar su uso como objetivos específicos de la angiogénesis modulaters 12. Inicialmente, el ensayo seutilizado en gran medida en los conejos, que son más fáciles de trabajar debido a su tamaño, pero más tarde el modelo fue traducido en ratones; un modelo animal más pequeño y menos caro. El cambio de conejo a ratones proporcionan una importante ventaja de ser capaz de utilizar animales manipulados genéticamente, creando así una nueva área de investigación sobre los componentes genéticos que afectan la angiogénesis 13. Además del uso más aceptable de ensayo de la córnea en el estudio de la angiogénesis, otros procesos biológicos también pueden ser investigados utilizando ensayos modificados. Por ejemplo, se realizaron estudios de linfangiogénesis posible a través de la implantación de gránulos de bajas dosis de bFGF que permitieron la visualización de los vasos linfáticos a través de marcadores moleculares específicos 14. Además, este ensayo ha proporcionado un medio para evaluar los efectos de la radiación sobre la angiogénesis 15. En resumen, el ensayo de angiogénesis microbolsa corneal es una cuantitativa, reproducible, evaluación flexible de la angiogénesis in vivo. Una ventaja importante de este ensayo es que la medición de los buques de fondo es innecesaria porque los vasos crecen en un tejido avascular naturalmente. Se describe aquí el protocolo de este ensayo en los detalles y discutir diferentes escenarios que pueden ocurrir. El ensayo consta de 3 segmentos discretos. Aquí vamos a describir la preparación de gránulos de factor de crecimiento incluido, la implantación quirúrgica posterior y, finalmente, el método utilizado para cuantificar el crecimiento neovascular resultante.

<table><tbody><tr><td>Section 1: Pellet preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucralfate</td><td>Sigma</td><td>#S0652</td><td></td></tr><tr><td>Hydron (aka Poly(2-Hema))</td><td>Sigma</td><td>#P3932-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco Products Inc</td><td>#111000200CSGL</td><td></td></tr><tr><td>Growth factors:</td><td></td><td></td><td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fibroblast growth factor (FGF)</td><td>PeproTech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td><td>R D Systems</td><td>#293-VE-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>35 mm dish</td><td>Becton-Dickson</td><td>#353001</td><td>Used for storage of pellets</td></tr><tr><td>10 cm petri dish</td><td>VWR</td><td>#25384-342</td><td>Used as work surface for preparing pellets</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Sefar America</td><td>#03--300/51</td><td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td></tr><tr><td>Spatulas</td><td>Fisher Scientific</td><td>#21-401-10</td><td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-408-146</td><td>One for hydron, one for sucralfate</td></tr><tr><td>Jewelers forceps, #5</td><td>Ambler Surgical</td><td>#2315E</td><td>Need 2 for pulling mesh apart</td></tr><tr><td>Centrifugal evaporator</td><td>ThermoSavant</td><td>DNA110 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Section 2: Surgical implantation of pellets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operating microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5% Avertin</td><td></td><td></td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td><td>Falcon</td><td>NDC# 6131401601</td><td>Eye anesthetic</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td><td>Bausch Lomb</td><td>NDC# 2420878055</td><td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td></tr><tr><td>Ophthalmic microknife, 5 mm</td><td>Surgistar</td><td>#924501</td><td>30 degree angle</td></tr><tr><td>von Graef knife</td><td>Ambler Surgical</td><td>#3401E</td><td></td></tr><tr><td>Jewelers forceps, #1</td><td>Ambler Surgical</td><td>#2301E</td><td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td></tr><tr><td>Jewelers forceps, #5</td><td>Ambler Surgical</td><td>#2305E</td><td>For picking up pellets and placing on eye</td></tr><tr><td>Small curved scissors</td><td>Ambler Surgical</td><td>#5636E</td><td>For trimming whiskers</td></tr><tr><td>Gauze</td><td></td><td></td><td>For blotting eye after proparacaine</td></tr><tr><td>Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5% Avertin</td><td></td><td></td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>Slit lamp</td><td>Nikon</td><td>FS-2</td><td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td></tr></tbody></table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

El ensayo de microbolsa de córnea de ratón es un ensayo robusto y cuantitativa in vivo para la evaluación de la angiogénesis. Mediante el uso de gránulos de liberación lenta estandarizadas que contienen factores de crecimiento específicos que activan el crecimiento de vasos sanguíneos a lo largo de la córnea avascular, naturalmente, la angiogénesis puede medirse y cuantificarse. En este ensayo se genera la respuesta angiogénica en el transcurso de varios días, dependiendo del tipo y la dosis del factor de crecimiento utilizado. La inducción de neovascularización son generalmente accionadas por cualquiera de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Mediante la combinación de estos factores de crecimiento con sucralfato y Hydron (poli-HEMA (poli (metacrilato de 2-hidroxietilo))) y la mezcla de fundición en forma de gránulos, que pueden ser implantados quirúrgicamente en el ojo del ratón. Estos gránulos uniformes lentamente a la liberación Los factores de crecimiento durante cinco o seis días (bFGF o VEGF, respectivamente) que permite suficiente respuesta angiogénica requerido para el área del vaso quantification usando una lámpara de hendidura. Este ensayo se puede utilizar para diferentes aplicaciones, incluyendo la evaluación de medicamentos o tratamientos moduladores angiogénicos así como la comparación entre los diferentes fondos genéticos que afectan a la angiogénesis. Un investigador experto después de practicar este ensayo puede implantar un pellet en menos de 5 min por ojo.

Los resultados típicos para bFGF y VEGF pellets en los bajos angiogénicos C57BL / 6J normales se muestran en la Figura 2A y B, respectivamente. Figura 2E muestra la distribución normal de área del vaso (VA) en el / cepa C57BL 6J con dosis variables de estos crecimiento factores. 80 pelets de bFGF ng normalmente dan como resultado un VA de aproximadamente 2,0 mm 2, aunque los valores en una gama de 1.8 a 2.4 mm 2 son aceptables. 200 ng de VEGF g...

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The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

El protocolo describe el microensayo corneal como desarrollado en ratones.

El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

the-corneal-micropocket-assay-a-model-of-angiogenesis-in-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K vistas.  Boston Children's Hospital.  El protocolo describe el microensayo corneal como desarrollado en ratones. 

Video: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Un modelo de ratón de la Prueba de bolsillo para el Estudio de la angiogénesis de córnea

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Investigación

Medicina

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Neurociencias

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Una Lesión álcalis quemar modelo de neovascularización corneal en el ratón

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biología

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Neovascularization del diafragma como un modelo de ratón de iridis del rubeosis inducida por la punción

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

Desarrollo de un Modelo Experimental No Invasivo, Asistido por Láser de Pérdida Celular Endotelial Corneal

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell (EC) proliferation assays using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs) or isolated primary retinal ECs are widely used in vitro models to study retinal angiogenesis. However, isolating pure murine retinal endothelial cells is technically challenging and retinal ECs may have different proliferation responses than choroidal endothelial cells and different cell/cell interactions. A highly reproducible ex vivo choroidal sprouting assay as a model of choroidal microvascular proliferation was developed. This model includes the interaction between choroid vasculature (EC, macrophages, pericytes) and retinal pigment epithelium (RPE). Mouse RPE/choroid/scleral explants are isolated and incubated in growth-factor-reduced basal membrane extract (BME) (day 0). Medium is changed every other day and choroid sprouting is quantified at day 6. The images of individual choroid explant are taken with an inverted phase microscope and the sprouting area is quantified using a semi-automated macro plug-in to the ImageJ software developed in this lab. This reproducible ex vivo choroidal sprouting assay can be used to assess compounds for potential treatment and for microvascular disease research to assess pathways involved in choroidal micro vessel proliferation using wild type and genetically modified mouse tissue.

This protocol presents choroid sprouting assay, an ex vivo model of microvascular proliferation. This assay can be used to assess pathways involved in proliferating choroidal micro vessels and assess drug treatments using wild type and genetically modified mouse tissue.

Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Estudio de la angiogénesis mediante ensayos de migración de heridas por arañazo y germinación de esferoides

Investigating Angiogenesis on a Functional and Molecular Level by Leveraging the Scratch Wound Migration Assay and the Spheroid Sprouting Assay

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A detailed understanding of the underlying molecular mechanisms and reliable screening models are essential for targeting diseases effectively and developing new therapeutic options. Several in vitro assays have been developed to model angiogenesis, capitalizing on the opportunities a controlled environment provides to elucidate angiogenic drivers at a molecular level and screen for therapeutic targets.
This study presents workflows for investigating angiogenesis in vitro using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We detail a scratch wound migration assay utilizing a live cell imaging system measuring endothelial cell migration in a 2D setting and the spheroid sprouting assay assessing endothelial cell sprouting in a 3D setting provided by a collagen matrix. Additionally, we outline strategies for sample preparation to enable further molecular analyses such as transcriptomics, particularly in the 3D setting, including RNA extraction as well as immunocytochemistry. Altogether, this framework offers scientists a reliable and versatile toolset to pursue their scientific inquiries in in vitro angiogenesis assays.

Autor destacado: Investigación de la angiogénesis a través de desafíos e innovaciones en el desarrollo de ensayos

This study presents the two-dimensional (2D) scratch wound migration assay and the three-dimensional (3D) spheroid sprouting assay, along with their respective downstream analysis methods, including RNA extraction and immunocytochemistry, as suitable assays to study angiogenesis in vitro.

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A ...

El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón

Resumen

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Un modelo de ratón de la Prueba de bolsillo para el Estudio de la angiogénesis de córnea

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Una Lesión álcalis quemar modelo de neovascularización corneal en el ratón

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Rata mesenterio ensayo angiogénesis

Neovascularization del diafragma como un modelo de ratón de iridis del rubeosis inducida por la punción

Desarrollo de un Modelo Experimental No Invasivo, Asistido por Láser de Pérdida Celular Endotelial Corneal

Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.