각막 내피 세포 손실에 대한 현재 질병 모델은 내피의 파괴에 초점을 맞추고 각막 이식이 불가피할 때 질병의 최종 단계를 나타낼 가능성이 높습니다. 줄기 세포 또는 유전자 치료를 사용 하 여 새로운 치료, 그러나, 질병의 초기 단계에 대 한 더 유용 할 수 있는 지금 사용할 수 있습니다., 부족 하는 모델. Nd:YAG 레이저를 이용한 광분열에 의한 비침습적 안구 수술은 안과 의사를 위한 일상적인 절차가 되었습니다.
현지 아바토이르로부터 갓 포신한 돼지 눈을 얻은 후, 샘플을 섭씨 4도에 전체 배지로 놓습니다. 가위를 사용하여 세포외 조직을 제거하고 5 분 동안 5 %의 포비도네 요오드 안과 용액으로 눈을 흡수하십시오. 다음으로, 소독된 샘플을 실온에서 멸균 PBS에 놓습니다.
스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 장치를 사용하여 각막 흉터, 부종 및 기타 불투명성과 같은 주요 전방 세그먼트 병리를 검사합니다. 스크리닝 후, 1, 064 나노미터의 파장을 가진 Nd:YAG 레이저가 장착된 슬립 램프 유닛 앞에 눈을 배치하고 공기 중10 마이크로미터의 초점 지점 직경을 배치합니다. 12X 배율을 선택하고 조명을 편향하여 개별 각막 레이어를 시각화합니다.
각막 내피 세포의 선택적 절제를 위한 적절한 파라미터에 펄스 에너지 및 초점 지점을 설정한 후 조직에 여러 레이저 주사를 적용한다. 그런 다음 해부 현미경하에서 명확한 각막 기생충을 림두에 가깝게 놓고 점성탄성을 주입하여 전방 챔버를 안정화시하십시오. 그런 다음 8mm 트레핀을 사용하여 레이저 처리 된 중앙 각막을 절제하고 고립 된 각막을 12 웰 플레이트 내피 측의 한 우물에 놓습니다.
각막이 모두 수집되면 각 샘플에 3밀리미터의 전체 배지를 잘 추가하고 37°C에서 최대 3일 동안 표본을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 소렌슨의 버퍼에서 메탄올이 없는 4%파라포름알데히드로 각각 의 배지를 실온에서 20분 간 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 정류관이 가라앉을 때까지 PBS에서 약 1시간 동안 고정 샘플을 PBS에 20% 자당에 놓습니다.
샘플을 PBS에서 하룻밤 사이에 30% 자당으로 옮김한 후 최적의 절삭 온도에 조직을 포함하여 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 영하 27도로 설정된 저온을 사용하여 1분 이내에 현미경 슬라이드에서 각 부분을 수집하는 냉동 조직의 10 마이크로미터 두께 섹션을 얻습니다. 그런 다음 슬라이드를 영하 80도에서 스테인딩할 때까지 보관합니다.
헤마톡슬린과 에오신 염색의 경우, 공기는 50 밀리리터 튜브에서 0.1%의 메이어의 헤마톡슬린으로 염색하기 전에 몇 분 동안 냉동 섹션을 건조시켜 수분을 제거합니다. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 이중 증류수로 5분간 헹구십시오. 다음으로, 슬라이드를 0.5%에 10번 찍어 두 번 증류수로 헹구고, 에오신이 줄무늬가 멈출 때까지 이중 증류수에 헹구십시오.
헹구는 슬라이드를 50%에탄올로 10회, 70%에탄올에 10회 찍어 보세요. 마지막 70%에탄올 딥 후, 95%에탄올로 30초 간 구간을 한층 더 보정한 후, 100%에탄올에서 60초가 지나자 자일렌에 몇 번 의욕을 불어넣습니다. 그런 다음 가벼운 현미경에 이미지를 얻기 전에 커버 슬립으로 표본을 장착합니다.
두 개의 광자 및 가벼운 현미경 이미지는 손상, 너무 많은 손상 또는 정확한 손상량으로 독립적으로 평가되어야 합니다. 이러한 평가에 기초하여, 열지도는 주변 조직에 최소한의 손상으로 각막 내피 세포의 선택적 절제를 위한 레이저 파라미터의 올바른 별자리를 선택하도록 계산될 수 있다. 이전 분석은 레이저의 초점이 테스트 된 가장 낮은 펄스 에너지에 대한 각막 내피의 뒤에 적어도 0.15 밀리미터이어야한다는 것을 결정했다.
2.9 밀리줄보다 높은 펄스 에너지의 경우, 테스트된 가장 긴 초점 거리는 여전히 내피에 너무 가깝습니다. 절제된 견본이 문화에 있는 동안 각종 세포 보호 제는 시험될 수 있습니다. 성공이 입증되면 치료를 위한 관개 솔루션에 추가할 수 있습니다.
