角膜内皮細胞喪失の現在の疾患モデルは、内皮の破壊に焦点を当て、角膜移植が避けられない疾患の最終段階を表す可能性が高い。しかし、幹細胞や遺伝子治療を使用した新しい治療法は、病気の初期段階、欠けているモデルのためにより有用である可能性があります。Nd:YAGレーザーを用いた光破壊による非侵襲的眼内手術は、眼科医にとって日常的な処置となっている。
地元のアバトワールから新鮮なブタの目を得た後、サンプルを摂氏4度のフル培地に入れます。はさみを使って細胞外組織を取り除き、5%ポビトンヨウ素眼科溶液に5分間目を浸します。次に、消毒したサンプルを滅菌PBSに室温で置く。
スペクトル領域光学コヒーレンス断層撮影装置を使用して、角膜瘢痕、浮腫、およびその他の不透明度などの主要な前部セグメント病理について眼をスクリーニングする。スクリーニング後、波長1,064ナノメートルのレーザーと10マイクロメートルの焦点点直径を備えたスリップランプユニットの前に目を置きます。12倍の倍率を選択し、照明をそらして個々の角膜層を視覚化します。
パルスエネルギーとフォーカスポイントを角膜内皮細胞の選択的切り出しに適切なパラメータに設定した後、組織にいくつかのレーザーショットを適用する。次に、解剖顕微鏡の下に、透明な角膜パラセンテーゼを四肢の近くに置き、粘弾性を注入して前房を安定させる。その後、8ミリメートルトレフィンを使用してレーザー処理中央角膜を切除し、単離した角膜を12ウェルプレート内皮側の1つの井戸に入れる。
すべての角膜が採取されたら、各サンプルに3ミリメートルのフル培地をよく加え、37°Cで最大3日間培養します。インキュベーションの終了時に、各ウェルの培地をソレンセンの緩衝液中のメタノールフリー4%パラホルムアルデヒドに交換し、室温で20分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、角膜が沈むまで約1時間PBSで20%スクロースに固定サンプルを入れます。
サンプルをPBSで一晩30%スクロースに移し、組織をマイナス80°Cで貯蔵するための最適な切断温度に埋め込みます。氷頭をマイナス27度に設定して、取得してから1分以内に顕微鏡スライド上の各セクションを採取する凍結組織の厚さ10マイクロメートルの部分を得ます。その後、スライドを染色するまでマイナス80度で保存します。
ヘマトキシリンとエオシン染色の場合、凍結した切片を数分間乾燥させてから、50ミリリットルチューブで10分間濾過した0.1%のメイヤーのヘマトキシリンで染色する前に水分を取り除きます。インキュベーションの終わりに、キュベットでスライドを二重蒸留水で5分間すすぐります。次に、スライドを0.5%eosinに10回浸し、続いて、エオシンがストリーキングを止めるまで二重蒸留水でディップリンスを行います。
リンススライドを50%エタノールで10回、70%エタノールで10回浸します。最後の70%エタノールディップ後、95%エタノールで30秒間平衡化し、その後に100%エタノールで60秒後にキシレンで数回浸出する。次に、光顕微鏡で画像を取得する前に、カバースリップで標本を取り付けます。
2つの光子顕微鏡画像は、損傷なし、多すぎる損傷、または損傷の正確な量として独立して評価する必要があります。これらの評価に基づいて、ヒートマップを計算して、周囲の組織への損傷を最小限に抑えた角膜内皮細胞の選択的切り落としのためのレーザーパラメータの正しい星座を選択することができます。以前の分析では、レーザーの焦点は、テストされた最も低いパルスエネルギーのために角膜内皮の少なくとも0.15ミリメートル後ろになければならないと判断しました。
パルスエネルギーが2.9ミリジュールより高い場合、テストされた最も長い焦点距離はまだ内皮に近すぎます。切除された標本が培養中である間、種々の細胞保護剤を試験することができる。成功した場合、それらは治療のための洗浄液に加えることができる。
