Aktuelle Krankheitsmodelle für den Verlust von Hornhaut-Endothelzellen konzentrieren sich auf die Zerstörung des Endothels und stellen eher die letzten Stadien der Krankheit dar, wenn eine Hornhauttransplantation unvermeidlich ist. Neue Behandlungen mit Stammzellen oder Gentherapie sind jetzt jedoch verfügbar, die für die frühen Stadien der Krankheit nützlicher sein könnten, für die Modelle fehlen. Die nichtinvasive intraokulare Chirurgie durch Photodisruption mit einem Nd:YAG-Laser ist zu einem Routineverfahren für Augenärzte geworden.
Nachdem Sie frisch enukleierte Schweineaugen aus dem lokalen Schlachthof erhalten haben, legen Sie die Proben in vier Grad Celsius volles Medium. Verwenden Sie eine Schere, um das extrazelluläre Gewebe zu entfernen und die Augen in 5%Povidon Jod ophthalmologische Lösung für fünf Minuten einweichen. Als nächstes legen Sie die desinfizierten Proben in sterilen PBS bei Raumtemperatur.
Mit einem spektralen Bereich optische Kohärenz Tomographie Gerät, überprüfen Sie die Augen für große vordere Segment Pathologien wie Hornhautnarben, Ödeme, und andere Trübungen. Positionieren Sie nach dem Screening die Augen vor einer Rutschlampeneinheit, die mit einem Nd:YAG-Laser mit einer Wellenlänge von 1.064 Nanometern und einem Brennpunktdurchmesser von 10 Mikrometern in der Luft ausgestattet ist. Wählen Sie die 12-fache Vergrößerung aus und lenken Sie die Beleuchtung ab, um die einzelnen Hornhautschichten zu visualisieren.
Nachdem Sie die Pulsenergie und den Fokuspunkt auf die entsprechenden Parameter für die selektive Ablation der hornhauten Endothelzellen gesetzt haben, wenden Sie mehrere Laseraufnahmen auf das Gewebe an. Dann unter einem Sezieren Mikroskop, legen Sie eine klare Hornhaut paracentesis in der Nähe des Limbus und injizieren viskolastisch, um die vordere Kammer zu stabilisieren. Verwenden Sie dann ein acht Millimeter Trephin, um die laserbehandelte zentrale Hornhaut zu verbrauchen und legen Sie die isolierte Hornhaut in einen Brunnen einer 12-Well-Platte endotheliale Seite nach oben.
Wenn alle Hornhäuten gesammelt wurden, fügen Sie drei Millimeter volles Medium zu jeder Probe gut hinzu und bebrüten die Proben für bis zu drei Tage bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation das Medium in jedem Brunnen durch methanolfreies 4%Paraformaldehyd in Sorensens Puffer für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur ersetzen. Am Ende der Inkubation die fixen Proben in 20%Saccharose in PBS für etwa eine Stunde legen, bis die Hornhäuten sinken.
Übertragen Sie die Proben über Nacht in 30% Saccharose in PBS, bevor Sie das Gewebe in eine optimale Schnitttemperatur für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius einbetten. Verwenden Sie einen Kryostat, der auf minus 27 Grad Celsius eingestellt ist, um 10 Mikrometer dicke Abschnitte des gefrorenen Gewebes zu erhalten, das jeden Abschnitt auf einem Mikroskopschlitten innerhalb einer Minute nach seiner Erfassung sammelt. Dann lagern Sie die Dias bei minus 80 Grad Celsius bis zur Färbung.
Für Hämatoxylin- und Eosinfärbung die gefrorenen Abschnitte für einige Minuten an der Luft trocknen, um Feuchtigkeit zu entfernen, bevor sie mit gefiltertem 0,1%Mayer-Hämatoxylin 10 Minuten lang in einem 50-Milliliter-Rohr färben. Am Ende der Inkubation die Dias in doppelt destilliertem Wasser für fünf Minuten in einer Küvette abspülen. Als nächstes tauchen Sie die Dias in 0,5%eosin 10 mal, gefolgt von Dip Spülung in doppelt destilliertem Wasser, bis das Eosin aufhört zu streifen.
Tauchen Sie die entspülten Dias 10 Mal in 50% Ethanol und 10 mal in 70% Ethanol. Nach dem letzten 70%ethanol Dip, gleicht die Abschnitte in 95%Ethanol für 30 Sekunden, gefolgt von 60 Sekunden in 100%Ethanol vor mehreren Dips in Xylol. Montieren Sie dann die Proben mit Deckslip, bevor Sie Bilder auf einem Lichtmikroskop erhalten.
Zwei Photonen- und Lichtmikroskopiebilder sollten unabhängig voneinander bewertet werden, da kein Schaden, zu viel Schaden oder korrekte Schadensmenge entstehen. Auf der Grundlage dieser Bewertungen kann dann eine Heatmap berechnet werden, um die richtige Konstellation von Laserparametern für die selektive Ablation der hornhauten Endothelzellen mit minimalen Schäden am umgebenden Gewebe auszuwählen. Frühere Analysen haben ergeben, dass der Brennpunkt des Lasers mindestens 0,15 Millimeter hinter dem Hornhautendothel liegen muss, um die niedrigste getestete Pulsenergie zu haben.
Bei Pulsenergien über 2,9 Millijoule ist die längste getestete Brennweite noch zu nah am Endothel. Verschiedene zytoprotektive Mittel können getestet werden, während die ausgeschnittenen Proben in Kultur sind. Wenn sich dies als erfolgreich erwiesen hat, können sie der Bewässerungslösung zur Behandlung hinzugefügt werden.
