Este protocolo tiene como objetivo utilizar organoides cerebrales para estudiar enfermedades mitocondriales. Fue desarrollado para generar organoides cerebrales reproducibles en la evaluación de sus propiedades mitocondriales. Este método no requiere biorreactores costosos y procedimientos de incrustación que consumen mucho tiempo.
Por lo tanto, es fácil de implementar y escalar. Este protocolo permite generar organoides cerebrales reproducibles y probar sus propiedades mitocondriales. Esto puede conducir a la identificación de objetivos de intervención para enfermedades mitocondriales intratables.
Para comenzar, cultive iPSC humanas en condiciones libres de alimentación en medio iPSC en placas recubiertas de seis pocillos y manténgalas en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Pase las iPSC al 80% de confluencia utilizando un medio de desprendimiento libre de enzimas en proporciones que van de uno por cuatro a uno por 12. Para aumentar la supervivencia celular, agregue 10 micromolares de proteína quinasa asociada a rho o inhibidor de ROCK después de cada división.
Disociar el 80% de iPSCs en el día cero. Preparar el medio de diferenciación cortical uno o CDM1 y precalentarlo a temperatura ambiente antes de añadirlo a las células. Lave los pozos que contienen las iPSC con PBS para eliminar las células muertas y los escombros.
Agregue 500 microlitros de reactivo A precalentado a cada pozo e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Verifique bajo el microscopio para asegurar el desprendimiento celular. Añadir un mililitro de medio iPSC para diluir el reactivo A y neutralizar su actividad.
Use una pipeta de 1.000 microlitros para disociar las células mediante tuberías hacia arriba y hacia abajo y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugue suavemente las iPSC a 125 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego aspire cuidadosamente el sobrenadante para evitar perturbar la bolita celular. Resuspend el pellet con un mililitro de CDM1 para obtener una suspensión de una sola célula y contar el número de células.
Preparar el medio de siembra con 9.000 iPSCs por cada 100 microlitros en CDM1 suplementado con 20 inhibidores micromolares de ROCK, tres inhibidores micromolares de catenina WNT o IWR-1, y cinco micromolares SB-431542. Agregue 100 microlitros de medio de siembra por pozo a una placa inferior en V de 96 pocillos. Mantenga la placa en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Para generar neuroesferas, desde el primer día, observe que se están formando agregados celulares redondos con bordes lisos definidos. Observe las celdas muertas alrededor de los agregados. Continúe cultivando en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
En el tercer día, agite la placa golpeando los lados tres veces para separar las células muertas, luego agregue 100 microlitros de CDM1 complementados con 20 inhibidores micromolares de ROCK, tres micromolares IWR-1 y cinco micromolares SB-431542 a cada pozo. Mantenga la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. En el sexto día, retire cuidadosamente 80 microlitros del medio sobrenadante de cada pozo.
Evite tocar el fondo del pozo. Agregue 100 microlitros de CDM1 suplementados con tres micromolares IWR-1 y cinco micromolares SB-431542 a cada pozo e incube la placa. Repita el paso anterior después de cada tres días hasta el día 18.
El día 18, para transferir neuroesferas, prepare CDM2 y agregue 10 mililitros a una placa de cultivo celular de unión ultra baja de 100 milímetros. Use una pipeta de 200 microlitros con la punta cortada para transferir las neuroesferas redondas de la placa de 96 pocillos a la placa de cultivo celular de fijación ultra baja de 100 milímetros. Retire cinco mililitros de medio de la placa que contiene las neuroesferas y agregue cinco mililitros de CDM2 fresco.
Coloque la placa en un agitador orbital a 70 rotaciones por minuto dentro de una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cada tres días, aspire cuidadosamente el medio sobrenadante y reemplácelo con CDM2 fresco. Deje una pequeña cantidad del medio para evitar que las neuroesferas se sequen.
El día 35, prepare CDM3. Aspirar el medio de la placa y añadir 10 mililitros de CDM3 frío. Después de cambiar el medio, coloque la placa de nuevo en un agitador orbital a 70 rotaciones por minuto dentro de una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
Cambie el medio cada tres a cinco días dependiendo de la tasa de crecimiento según lo indique el color del medio. El día 70, prepare CDM4. Utilice el medio CDM4 hasta que se alcance la edad deseada de los organoides.
Durante este período, mantenga la placa en un agitador orbital a 70 rotaciones por minuto dentro de una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio cada tres a cinco días dependiendo de la tasa de crecimiento. Prepare la solución 4% PFA y colóquela debajo de una campana de seguridad.
Recoja los organoides cerebrales y transfiéralos suavemente con una pipeta Pasteur de plástico de tres mililitros con punta roma a una placa de seis pocillos llena de PFA. Mantenga los organoides en la solución de PFA durante una hora a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente el PFA con una pipeta Pasteur de plástico de tres mililitros y lave los organoides fijos tres veces con PBS.
Guarde los organoides fijos a cuatro grados Celsius en PBS hasta su uso posterior. Los organoides generados utilizando este protocolo contienen neuronas maduras que se pueden visualizar utilizando marcadores de proteínas específicos para axones y dendritas. Los organoides maduros contienen no solo células neuronales, sino también células gliales.
Utilizando el análisis de organoides cerebrales en rodajas, es posible monitorear los axones positivos SMI 312 y las dendritas positivas MAP2 o las células gliales beta S100. Además, las imágenes confocales ayudan a investigar la distribución detallada y la organización de los progenitores neuronales positivos SOX2 con respecto a las neuronas positivas de tubulina beta-3. Los organoides cerebrales se tiñeron para marcadores específicos de mitocondrias, como la translocasa de la membrana externa o TOM20.
El perfil bioenergético de los organoides cerebrales se realizó midiendo tanto el metabolismo mitocondrial utilizando la tasa de consumo de oxígeno, u OCR, como el metabolismo glicolítico utilizando la tasa de acidificación extracelular, o ECAR. La oligomicina causa una caída en el perfil de OCR y, por lo tanto, identifica el OCR necesario para la producción de ATP. Tras el tratamiento con oligomicina, también puede haber un aumento compensatorio en ECAR que sugiere que las células pueden regular al alza la glucólisis para prevenir el estrés metabólico.
Al transferir las neuroesferas de la placa de 96 pocillos a una placa de cultivo o durante el procedimiento de fijación, es crucial manejar los organoides suavemente para evitar dañarlos. Después de la generación de organoides cerebrales, la matriz de electrodos múltiples o las imágenes de calcio serían métodos ideales para probar la funcionalidad de los organoides.
