La técnica que presentamos hoy permite el análisis de la actividad neuronal de la médula espinal como resultado del factor neuronal intrínseco y la influencia de los astrocitos circundantes. Esta técnica genera de manera confiable tanto neuronas humanas como astrocitos humanos que son específicos de la médula espinal y utiliza una medida de salida funcional que se puede escalar para la reproducibilidad. La técnica que presentamos permite investigar enfermedades específicas de las neuronas de la médula espinal, como la esclerosis lateral amiotrófica, utilizando neuronas de pacientes con enfermedad esporádica o genética.
Para empezar, examine las placas iPSC humanas en busca de colonias suficientemente densas de modo que el centro de las colonias muestre áreas blancas dispersas. Luego, para comenzar a empaquetar las celdas, dibuje líneas de cuadrícula en la superficie exterior inferior de las placas con un marcador para facilitar la cobertura precisa de toda la placa. Utilice un microscopio de contraste de fase de aumento de 10x en una campana de cultivo para separar colonias diferenciadas raspando manualmente con una punta de pipeta de 200 microlitros.
A continuación, enjuague las placas dos veces con PBS. Y luego agregue cinco mililitros de proteasa de disociación tisular precalentada a 37 grados centígrados. Incubar las células a 37 grados centígrados durante cuatro a siete minutos hasta que los bordes de las colonias comiencen a redondearse, antes de levantar las colonias de la placa.
Aspire cuidadosamente la proteasa de disociación y enjuague suavemente la placa dos veces con PBS sin desalojar las colonias. Agregue cinco mililitros de medio iPSC humano precalentado a la placa de cultivo. Luego rasque toda la placa con una punta de una pipeta de cinco mililitros con un movimiento de ida y vuelta de arriba a abajo y levante las colonias mientras las divide en agregados de celdas más pequeñas.
Para la diferenciación de iPSC humanas en células progenitoras neurales. Una vez que la iPSC humana forma una monocapa y se convierte en 90% confluente, comience la diferenciación como se describe en el manuscrito. En el día 12, después del tratamiento con tripsina, si las células no están en suspensión, las células se desprenden mecánicamente expulsando el medio de inducción neural de una punta de pipeta de 1000 microlitros sobre las células con un movimiento circular para cubrir toda la superficie.
Si los cultivos de células progenitoras neurales se congelaron, descongérelas. Después del intercambio del medio y el enjuague de PBS como se describe en el manuscrito, cambie el medio con un medio de diferenciación de neuronas motoras que contenga 0.02 arabinósido de citosina micromolar y luego incube las células durante 48 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono cuando los progenitores comprometidos gliales emergen como células planas que proliferan bajo progenitores de neuronas motoras postmitóticas, agregados en grupos de células. Posteriormente, realizó el intercambio de medios como se indica en el manuscrito.
El día del recubrimiento o antes, comience a cubrir las placas MEA de 24 pozos diluyendo primero PLO en agua o PBS. Luego agregue de 15 a 20 microlitros de PLO a cada pocillo formando una gota en el centro del pozo, cubriendo el área del electrodo asegurando que no se dañen los electrodos con la punta de la pipeta. Agregue agua a los compartimentos que rodean los pozos, asegurando suficiente humedad.
E incubar PLO a 37 grados centígrados durante una o dos horas. Luego, usando una punta de micropipeta de plástico, aspire la mayor cantidad de PLO posible sin tocar los electrodos. A continuación, lave el pozo con 250 microlitros de agua tres veces.
Con la punta de una pipeta, retire la mayor cantidad de agua posible y deje que la superficie se seque con la tapa retirada. A continuación, agregue de 15 a 20 microlitros de laminina diluida para cubrir cada matriz de electrodos. Después de agregar agua a los compartimentos de humedad y reemplazar la tapa, incubar a 37 grados centígrados durante un mínimo de dos horas hasta toda la noche.
El día del recubrimiento, después de enjuagar las neuronas motoras y los cultivos de astrocitos una vez con PBS, agregue 0.05% de tripsina e incube a 37 grados centígrados durante unos cinco minutos para levantar las células. Recolectar células en un tubo cónico de 15 mililitros que contiene inhibidor de tripsina. Y lave las placas con medio o base para asegurarse de que todas las celdas se recogen.
Granular las células por centrificación. Y luego, utilizando una pipeta de 1000 microlitros, resuspender las neuronas motoras y los astrocitos con un medio de cocultivo que contiene 20 micromolares de inhibidor de ROCK para generar un mililitro de una suspensión de una sola célula. Usando un hemocitómetro, cuente las neuronas motoras y los astrocitos.
Y mientras contaba, mantenía las suspensiones celulares y las colocaba en una rejilla de espuma de poliestireno a cuatro grados centígrados. Centrifugar un mililitro de ambas suspensiones celulares a 300 veces G durante cinco minutos. Calcular el volumen deseado y resuspender los pellets.
Combine el volumen requerido de suspensiones de neuronas y astrocitos en proporciones iguales, y mezcle suavemente pipeteando dos veces para combinar bien. Luego retire la laminina de cada pocillo de la placa y transfiera 10 microlitros de la suspensión celular combinada final a cada pozo, formando una pequeña gota que cubre la matriz de electrodos. Incubar las placas con una gota celular inalterada a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para formar uniones iniciales en las placas.
Luego pipetear 250 microlitros de medios de cocultivo calientes que contienen inhibidor de ROCK hacia abajo en la pared de cada pocillo y pipetear el mismo volumen en la pared opuesta de cada pocillo e incubar la placa a 37 grados centígrados durante 24 a 36 horas. Al día siguiente, examine las placas en busca de escombros o células muertas. Y si es necesario, intercambie el medio con un medio de cocultivo fresco que contenga inhibidor de ROCK.
De lo contrario, realice intercambios de medio medio dos veces por semana utilizando un medio de cocultivo sin un inhibidor de ROCK a partir del segundo día de cocultivo. Para realizar la grabación, comience tan pronto como sea posible después del primer día de cocultivo ajustando la temperatura a 37 grados centígrados y el dióxido de carbono al 5%, luego transfiera las placas a la máquina grabadora y equilibre durante al menos cinco minutos antes de grabar. Registre la actividad de referencia cada dos días o semanalmente durante uno a 15 minutos, dependiendo del diseño experimental.
Para investigar los efectos electrofisiológicos transitorios de los compuestos dirigidos a las neuronas o los astrocitos, retire la tapa de la placa pero mantenga la tapa de la máquina cerrada y registre la actividad basal durante un mínimo de un minuto. Abra manualmente la tapa de la máquina sin detener el registro electrofisiológico e intercambie 25 microlitros de medio con el vehículo farmacológico apropiado. Luego cierre la tapa manualmente y registre durante minutos adicionales si es necesario.
Del mismo modo, pruebe el medicamento de interés. En este protocolo, las hiPSC se mantuvieron y pasaron como colonias no confluentes. La neurogénesis se inició a través de la inhibición dual de SMAD mediante la inactivación de las vías BMP y TGF-beta.
Las células madre neuroepiteliales resultantes se dividieron y generaron un epitelio de múltiples capas. La exposición temprana a factores de crecimiento neuronal y un factor neurotrófico ciliar gliogénico generó una población mixta de células progenitoras. Las neuronas surgieron espontáneamente de esta población mixta.
El interruptor gliogénico indujo la diferenciación de astrocitos a través de la activación de la vía JAK-STAT. La identidad de la médula espinal de las células de la neurona motora tratadas con inhibidores de muesca y diferenciadas fue apoyada por altos niveles de expresión de colina acetiltransferasa. En el día 90 después del cultivo in vitro, los astrocitos iPSC humanos mostraron un fenotipo de maduración según lo indicado por la expresión de S100 beta y GFAP, mientras que su identidad regional de la médula espinal fue respaldada por la expresión de halcones antes.
Las células cocultivadas se reorganizaron espontáneamente con astrocitos creando una capa de alimentación en la parte inferior y neuronas que conectan redes en la parte superior. Las neuronas se agregaron en grandes grupos de células cuando se cultivaron solas, mientras que el cocultivo de neuronas motoras iPSC humanas con astrocitos iPSC humanos dio como resultado monocapas distribuidas uniformemente. Los astrocitos iPSC humanos mejoraron la maduración electrofisiológica de las neuronas motoras iPSC humanas, como lo demuestran los grados más altos de actividad de picos y ráfagas en los cocultivos.
En nuestra experiencia, el cultivo de células madre y la diferenciación temprana de NPC son los más difíciles y sensibles a los errores técnicos. En esta etapa, las técnicas no deben realizarse con consistencia y precisión con poco margen para la resolución de problemas. Las técnicas de cocultivo descritas aquí también se pueden usar en otros modelos específicos de tipo celular.
