Este método permite que la estructura celular y la función se perturen a través de la fusión de dos tipos de células diferentes para abordar preguntas tales como cómo responden las células a los cambios en el número de orgánulo. Mediante la toma de imágenes de proteínas etiquetadas fluorescentmente dentro de las células fusionadas, las estructuras celulares se pueden hacer referencia de nuevo a su tipo de célula de origen para estudiar los mecanismos de la homeostasis y la función del orgánulo. Para el etiquetado de tintes fluorescentes, vea las poblaciones de células cancerosas humanas de interés de tal manera que cada cultivo se habrá expandido a por lo menos seis veces 10 a las sextas células en una confluencia de 70 a 90% para la mañana siguiente.
El día del etiquetado, lave dos veces las células de rootletina eGFP y rootletin-mScarlet con 10 mililitros de PBS por lavado. Diluir el tinte celular violeta a 500 nanomolares en PBS y teñido de células rojas lejanas a 200 nanomolares en PBS. Etiquete las células de rootletin eGFP con el tinte celular violeta diluido y las células de rootletin-mScarlet con el tinte de células rojos lejanos diluido durante un minuto a temperatura ambiente.
Al final de las incubaciones, detenga las reacciones con 10 mililitros de DMEM durante cinco minutos. Lave tanto cultivos celulares etiquetados como un cultivo celular parental sin etiquetar con 10 mililitros de PBS fresco antes de incubar todos los cultivos con un mililitro de trippsina precalentada. Al final de la incubación, transfiera las soluciones celulares separadas a tubos cónicos individuales de 15 mililitros para centrifugación y resuspende suavemente los pellets etiquetados con tinte en un mililitro de PBS y las células sin etiquetar en un mililitro de DMEM.
A continuación, devuelva todas las muestras de celda a la incubadora de cultivo celular. Para el experimento de fusión celular, mezcle 500 microlitros de células etiquetadas con tinte violeta con 500 microlitros de células etiquetadas con tinte Rojo Lejano en un nuevo tubo de 15 mililitros y sedimente las células etiquetadas no mezcladas restantes por centrifugación. Resuspender los pellets en un mililitro de DMEM fresco y colocar las células de nuevo en la incubadora.
Recoger las células mixtas por centrifugación y añadir 700 microlitros de 50%1450 PEG de una manera gota a la bola durante un período de 30 segundos. Después de 3,5 minutos a temperatura ambiente, agregue 10 mililitros de DMEM sin suero en un período de 30 segundos y coloque los tubos en la incubadora durante 10 minutos. Al final de la incubación, sedimentar las células mixtas por centrifugación y resuspend suavemente el pellet en un mililitro de medio completo.
Para enriquecer para la población de células fusionadas por FACS, filtre suavemente todas las células en tubos FACS individuales a través de un colador de 70 micrómetros y cree tramas de dispersión hacia adelante frente frente a dispersión lateral y discriminación de doblete en el software del citometro. Ejecute las celdas sin etiquetar para registrar su intensidad de fluorescencia y crear puertas para identificar las celdas fusionadas. A continuación, ejecute el único tinte Violet positivo etiquetado con las células para confirmar que no hay derrame de señal violeta en el canal Rojo Lejano y el único tinte rojo Lejano positivo etiquetado células para confirmar que no hay señal de rojo lejano en el canal Violeta.
Luego ejecute brevemente la muestra de fusión para confirmar que las células fusionadas son visibles con estas puertas. Cuando se hayan establecido los parámetros de clasificación, alinee el flujo de clasificación de forma centralizada en una placa de imágenes de ocho pozos que contenga 100 microlitros de medio de crecimiento y clasif sino las células fusionadas positivas dobles directamente en el plato. Cuando todas las células hayan sido ordenadas, coloque inmediatamente el plato en la incubadora de cultivo celular durante dos a 16 horas.
Para la tinción inmunofluorescente, primero reemplace el sobrenadante de cultivo celular por 200 microlitros de 4%paraformaldehído para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la fijación, lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS por lavado antes de permeabilizar las células en 200 microlitros de 0.1%surfactante no iónico durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, bloquee la unión inespecífico con 200 microlitros de albúmina sérica bovina al 3% bovina en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de un etiquetado con los anticuerpos de interés en 150 microlitros de tampón de tinción.
Después de una hora a temperatura ambiente, lave las células dos veces en 300 microlitros de PBS durante cinco minutos por lavado. Después del último lavado, sustituya el lavado por 200 microlitros de PBS fresco. Para adquirir imágenes de las células fusionadas, utilice un microscopio de fluorescencia adecuado capaz de imágenes de cuatro colores y recopile imágenes tridimensionales.
Las células debidamente etiquetadas son visibles durante la citometría de flujo por señal fluorescente a un nivel más alto que las células de control sin etiquetar. Las puertas se pueden configurar para la clasificación para enriquecer para la población de células dobles positivas directamente en platos de imagen para un análisis microscópico adicional. La fusión induce una reorganización importante de la arquitectura celular a través de la mezcla de dos células en una.
Los heterokaryons se identifican como células que contienen ambas señales de tinte fluorescente mezcladas dentro de una sola célula sin intervenir membranas plasmáticas. Además, dos núcleos también pueden ser visibles en las células fusionadas por imágenes de Brightfield. La estructura y la función celulares pueden investigarse más a través de la fusión de células que contienen proteínas etiquetadas con meGFP y mScarlet.
La fusión da como resultado una duplicación del número centrosome dentro de los heterokaryons visibles como al menos cuatro focos de material pericentriolar cuando el componente pericentriolar centrosome NEDD1 está etiquetado fluorescentemente. La fusión de células con rootletina endógenamente etiquetada fluorescentemente permite identificar la célula de origen de cada centroomante en un heterokaryon. Este protocolo demuestra cómo fusionar líneas celulares etiquetadas diferencialmente y cómo crear imágenes de sus orgánulos para comprender su estructura y función.
Este protocolo robusto es relativamente fácil y relativamente barato de realizar en comparación con métodos similares. Esta técnica se puede utilizar para hacer una serie de preguntas tales como cómo se regula la fusión de organelos y cómo las células responden a los cambios en el número de orgánulo subcelular.
