El objetivo general de este método es inducir linfedema secundario consistente en la extremidad posterior de los ratones sin causar morbilidad grave. Este método se puede utilizar para inducir linfedema secundario en la extremidad posterior de los ratones. La principal ventaja de este método es que resuelve el linfedema insignificante que dura al menos ocho semanas sin causar morbilidad grave.
Alguien nuevo en el procedimiento puede tener problemas con las técnicas microquirúrgicas. Por lo tanto, recomendamos la formación microquirúrgica y varios procedimientos de práctica para asegurar un resultado exitoso, pero también para preparar al investigador para que pueda realizar el procedimiento de manera más eficiente. Configure la fuente de radiación y anestesice el ratón como se describe en el protocolo.
Coloque una almohadilla de plomo de 1,5 milímetros de espesor para asegurarse de que solo el área que se somete a cirugía se irradia. El ejemplo mostrado es de un ratón post-cirugía para aclarar el área. Administrar una dosis de 10 irradiación gris.
Los investigadores deben tomar precauciones al trabajar con radiación. Durante este experimento toda la irradiación se realizó en una habitación con aislamiento de radiación. Y la fuente de radiación sólo se encendió cuando todo el personal había salido de la habitación.
Pesar el ratón pre-cirugía. Examine la profundidad anestésica mediante una prueba de pellizcar de pata o cola. Afeitar la pierna elegida para el procedimiento.
Establezca el flujo de oxígeno en 0,8 litros por minuto. Conéctalo con un cono nasal. Aplicar pomada oftálmica.
Inyectar 0,5 mililitros de solución salina por vía subcutánea, preferiblemente en el escrúpulo del ratón para prevenir la hipovolemia durante la cirugía. Coloque el ratón sobre el paño quirúrgico en posición supina. Coloque el cono nasal sobre el hocico.
Fije el extremo de las extremidades posteriores suavemente con cinta adhesiva, para evitar que el ratón se desplace durante la cirugía. Levante la piel con fórceps lisos y recorte una pequeña abertura de aproximadamente cinco milímetros proximal a la fosa popliteal. Deslice las tijeras afiladas en la abertura y corte hacia la rodilla, de modo que la incisión termine justo por encima de la rodilla.
Asegúrese de no perforar los vasos subyacentes, levantando la piel con fórceps durante el recorte. Mueva el ratón a una posición propensa y complete la incisión circunferencial. Disecciona la piel a un par de milímetros por encima del ángulo.
Recuerde mantener el tejido húmedo con solución salina estéril durante todo el procedimiento. Retraer la piel de la herida proximal con un retractor elástico. Y asegúrese de que la vena ciática sea visible como se muestra.
Inyectar 0,01 mililitros Patentado Azul V por vía subcutánea entre el segundo y el tercer dedo del dedo del final. Presione suavemente la pata un par de veces para distribuir la patente azul V.La distribución de la patente azul V se puede ver a través del microscopio. Las estructuras que deben visualizarse son, el vaso linfático proximal, PLV, el ganglio linfático popliteal, PLN, el primer vaso linfático distal, DLV1, y el segundo vaso linfático distal, DLV2.
Ampliar para visualizar el PLV y ligarlo usando una sutura de nylon 10-0. Presione la pata para asegurarse de que ningún patente azul pasa proximal a la ligadura. Ligar los dos vasos linfáticos distales como se muestra.
Presione la pata varias veces de nuevo para asegurarse de que ningún Patent Blue V pasa proximal a la ligadura. En este ejemplo, se puede ver que uno de los vasos linfáticos estalla debido a la ligadura que dificulta el flujo linfático. Retire el ganglio linfático popliteal, el ganglio linfático tiene una superficie lisa similar a una perla y es coloreado por el Patent Blue V en contraste con el tejido graso circundante.
Antes de retirar la almohadilla de grasa inguinal, cauterice este recipiente como se muestra. A continuación, retire la almohadilla de grasa en una sola pieza. Asegúrese de que no haya sangrado activo.
Este es un ejemplo de un ganglio linfático inguinal localizado. El ganglio linfático situado en la almohadilla de grasa inguinal rara vez es coloreado por el Patent Blue V y puede ser difícil de diferenciar de la grasa. Extracción de la almohadilla de grasa en una sola pieza es la mejor manera de asegurarse de que el ganglio linfático se ha eliminado.
Sutura los bordes de la piel hasta la fascia muscular, con una sutura de nylon 6-0 usando fórceps y soporte de aguja, dejando un espacio de dos a tres milímetros, para restringir el flujo linfático superficial. Este es un ejemplo de las suturas terminadas, en la fosa popliteal, el lado lateral de la extremidad posterior, por encima de la rodilla, y el lado medial de la extremidad posterior. Administrar analgesia y pesar el ratón después de la cirugía, luego colocarlo en un gabinete calentado para su recuperación.
Repita el procedimiento para la irradiación pre-cirugía. Este gráfico muestra el volumen de la extremidad posterior media combinada de tres estudios separados en las ocho semanas posteriores a la cirugía. Se incluyeron 31 ratones en total.
El eje X representa semanas después de la cirugía. El eje Y representa el volumen de las extremidades posteriores en milímetros cúbicos. Las barras de flecha representan la desviación estándar.
Es de esperar que la hinchazón de la cirugía y el linfedema inducido disminuirá durante las primeras cuatro semanas. Después de las primeras cuatro semanas vemos un estado relativamente estable de linfedema. El volumen de la extremidad posterior de control aumenta durante las ocho semanas, diciendo así estrictamente la diferencia de volumen entre la extremidad posterior del linfedema y la extremidad posterior del control, esto fue inesperado.
Se especula que la causa es que los ratones usaron su extremidad posterior no operada más que la extremidad posterior operada en las semanas posteriores a la cirugía. Esto podría conducir a la hipertrofia de la extremidad posterior del control y tal vez explicar el aumento en el volumen. Para las cifras individuales de los tres estudios incluidos, lea el protocolo.
Esta tabla muestra la prueba de comparación múltiple de Sidak para las mediciones de volumen combinadas de los tres estudios incluidos. El valor P calculado muestra que hay una diferencia estadísticamente significativa entre las extremidades posteriores con linfedema inducido y las extremidades posteriores de control, durante las ocho semanas de seguimiento. Para el análisis estadístico individual de los tres proyectos incluidos, lea el protocolo.
Este método induce linfedema estadísticamente significativo, que dura al menos ocho semanas. El procedimiento se puede utilizar para estudiar la petrificialidad del linfedema e investigar nuevas opciones de tratamiento. Después de ver este video, usted debe haber obtenido una comprensión de cómo inducir linfedema secundario en la extremidad posterior de los ratones, utilizando una combinación de microcirugía y irradiación pre y post-cirugía.
Una vez dominado, el procedimiento quirúrgico se puede realizar en 45 minutos.
