Los autores desean agradecer a Andrew J Dunn, un destacado estudiante de pregrado de investigación en nuestro laboratorio, por su asistencia técnica y el cuidado de los animales. El Instituto Nacional de Salud de subvención HD058834 y la Universidad de Missouri Ciencias de la Vida de Becas financiado este trabajo.

Cirugía Pre-Instrumentos / Materiales <ul><li> Cortadoras de alambre / alicates </li><li> Gasa de 2 x 2 &quot;almohadillas </li><li> Almohadilla eléctrica </li><li> Palos de nitrato de plata </li><li> Guantes quirúrgicos estériles </li><li> Isoflurano anestésicos por inhalación, </li><li> El gluconato de clorhexidina al 4% (lavado quirúrgico antiséptico) </li><li> Estéril 2-0 sutura de acero quirúrgico </li><li> 25 x 5 / 8 Un indicador de aguja (autoclave) </li><li> Hemostático (autoclave) </li><li> Suturas quirúrgicas de acero </li></ul> Cirugía Procedimiento <ol><li> Crear un campo estéril. Siga el procedimiento estéril. </li><li> Anestesiar ratón con 2 - 3% isoflurano. </li><li> Coloque el ratón sobre el cojín eléctrico. </li><li> Scrub cola con solución de clorhexidina. </li><li> Localice 5, 6, o 7 º espacio intervertebral (entre dos protuberancias óseas en la cola, empieza a contar desde el final de vello corporal, en la base de la cola). </li><li> Use pinza hemostática y aguja 25G para hacer un agujero piloto entre dos vértebras, en el espacio intervertebral. </li><li> Use los cortadores de alambre para cortar la sutura de acero de 10 cm de largo. </li><li> Se retira la aguja e inserte sutura de acero a través del agujero de 5 cm de sutura en cada extremo de la cola. </li><li> Cada lado de la cola debe tener + 5 cm de sutura. </li><li> Coloque la punta del pulgar a la cola. </li><li> Use su mano libre y el viento de la sutura de acero en la punta de su dedo pulgar y gire los extremos para formar un lazo grande. La parte herida o circular debe ser + 3 mm de largo. </li><li> Retire el dedo pulgar. </li><li> Abrazadera de un hilo de sutura con la pinza hemostática y se dobla en un lazo más pequeño, al final del cual se adjunta en la mayor medida posible a la torcedura en el gran circuito original. </li><li> Cortar el exceso de cable, y la forma del cable trenzado. </li><li> Si hay algún sangrado excesivo, se puede detener con los palos de nitrato de plata. </li><li> Apagar el ratón isoflurano y el lugar en una jaula sola casa a recuperarse durante 5-7 días antes de la extremidad posterior descarga. Los anillos de la cola se enreda si más de un ratón se encuentra junto. </li></ol> 1. Miembro posterior descarga Procedimiento Materiales <ul><li> Tamaño 10.24 x 4 tornillos de la máquina, uno por cada animal. </li><li> Tuerca de bloqueo de nylon tamaño de 10 a 24, uno por cada animal. </li><li> Ala tuerca de tamaño 10 X 24, dos por cada animal. </li><li> Lavadora ¼ x 1, dos por cada animal. </li><li> Pesca giratoria con el tamaño del gancho de seguridad # 6, 1-11/16 &quot;, y uno por animal. </li><li> De metal máquina de coser de bolillos. Uno por animal. </li><li> Clip pequeño de S-en forma de gancho, uno por cada animal </li><li> Alicates. </li><li> 2 x 2 &quot;de gasa. </li><li> 2 &quot;negro abrazaderas de papel cuaderno. </li><li> Cinta adhesiva / cinta de laboratorio. </li><li> 1-3/8 &quot;chapado en acero ranurados barra que se extiende poco más allá de la longitud de la jaula </li><li> 50cm X 40cm X 20cm jaula (jaula de ratas). </li><li> Botella de agua con tubo doblado. </li><li> Alambre de acero inoxidable, en forma de U para apoyar una botella de agua. </li></ul> Jaula de la instalación <ol><li> Sentar las 1-38 &quot;chapado barra de acero con ranuras en la parte superior de la jaula, y la cinta que temporalmente con cinta adhesiva. </li><li> Un tornillo de palomilla al tornillo, una arandela, e introduzca el tornillo a través de la placa de acero ranurados ± 15 cm del borde de la jaula. </li><li> Añadir otra arandela y tuerca de mariposa. Apretar las tuercas de ala, pero no apriete, ya que será necesario hacer ajustes posteriores. </li><li> Inserte el tornillo de la máquina a través del agujero del centro de la bobina. </li><li> Para evitar que la bobina se caiga, tornillo de la tuerca de fijación de nylon para el final del tornillo de la máquina. La bobina debe girar libremente. </li><li> Inserte el gancho de seguridad giratorio de la pesca a través de la parte inferior de la bobina. </li><li> Utilice unos alicates para formar un gancho en forma de S del clip. (Corte 2 cm del clip en forma de anzuelo). </li><li> Inserte un extremo del gancho en forma de S a través del agujero de la pieza giratoria y una pizca de pesca se cerró con las pinzas. </li><li> Coloque el cable en forma de U, en paralelo al tornillo de la máquina, en el interior de la jaula de lado, y doble los extremos de nuevo a apoyar una botella llena de agua. </li><li> Inserte la botella de agua en el alambre en forma de U, con la Spicket hacia abajo, pero sin tocar el fondo. </li><li> Doble las dos &quot;carpeta pinza abierta, por lo que no puede cerrar cerca. Sólo la tensión suficiente para contener 3 a 4 piezas de los alimentos en ella sin que se caiga. Se trata de la prevención de la fuerza de la pinza de la molienda del alimento, o poner coto a la nariz del ratón. </li><li> Lugar 3 a 4 piezas de roedores chow en la pinza aglutinante. </li></ol> Miembro posterior descarga de ratón <ol><li> Inserte el extremo abierto del gancho en forma de S en el anillo más pequeño del anillo de la cola. </li><li> Ajuste la altura del ratón por apretar o aflojar la tuerca inferior del tornillo de la máquina. Las extremidades inferiores no se debe soportar peso. Una vez que la altura óptima se logra apretar la tuerca superior del ala. </li><li> Vuelva a colocar la botella de agua, y el alambre en forma de U, para que el ratón no se puede subir a la Spicket con sus patas traseras.<html> Asegure la botella de agua con cinta adhesiva a un lado de la jaula. </li><li> Coloque la abrazadera carpeta con los alimentos en la parte inferior de la jaula para que el ratón no se puede subir a ella, la cinta hacia abajo con cinta adhesiva. </li><li> Repita el mismo procedimiento si más de un animal es miembro posterior descarga en el otro lado de la jaula. Casa de dos animales por jaula, el espacio de los animales de modo que casi pueden tocarse. </li><li> Utilice el 2 X 2 gasa para envolver sin apretar la cola del ratón sobre el giro de pescado. Use un pedazo pequeño de cinta para envolver alrededor de la gasa, asegurando la gasa hasta la cola. Este paso es importante para evitar que la cola de la caída hacia abajo, dando lugar a la acumulación de sangre en la punta de la cola y que la cola de necrosarse. </li><li> Agregue una pequeña cantidad de camas mazorca a la jaula. No añada cama demasiado de lo contrario el ratón de un montón de ropa de cama y tratar de cargar patas traseras en las camas. </li></ol> 2. Los resultados representativos: Para establecer el éxito de la técnica de la cola de anillo HU se midieron el peso corporal del animal antes de la cirugía anillo de cola, y antes y después de Hungría y la recuperación, la masa del músculo sóleo y masa suprarrenal en todos los grupos. Peso corporal de los ratones durante todo el experimento se muestran en la Figura 1. Peso corporal de los ratones antes de la cirugía de cola de anillo (24,7 ± 3,5 g) no fueron significativamente diferentes después de 5 días de recuperación de la cirugía anillo de cola (24,3 ± 2.9g) antes de la HU. Ni el peso corporal de manera significativa disminución inmediatamente después de los 14 días de HU (22,7 ± 1,9 g), 28 días de HU (21,3 + 2,1 g) o la recuperación después de 3 días a partir de HU (24,0 ± 1,8 g). Aunque HU de 14 y 28 días dio lugar a una pequeña pérdida (-6,8% y el 12%), pero no significativa en la masa corporal, los ratones completamente recuperado de su pre-HU peso corporal después de 3 días de recuperación. El consumo de alimentos para los ratones control ambulatorio y ratones HU se muestra en la Figura 3. Ingesta diaria de alimentos no fue diferente en ratones HU durante 28 días en comparación con los controles. Se observó una atrofia significativa músculo sóleo siguientes HU de 14 y 28 días (-39,1%, -46,6% y) lo que indica un procedimiento eficaz de HU (Figura 2). Además, este grado de atrofia es coherente con los valores esperados para la literatura de 2-4 semanas de HU 2, 7, 8. Después de 3 días de la recuperación de la HU sóleo de masas aumentó significativamente a 74% de los valores de control. La masa del músculo sóleo en el grupo de recuperación fue significativamente mayor que los dos grupos HU, pero sigue siendo significativamente menor que los animales control ambulatorio. Pesos suprarrenales se mide como un indicador del estrés de los animales, tanto de las glándulas suprarrenales derecha e izquierda fueron extirpados y pesado. El peso promedio eran comparables para el control de los ratones y los ratones HU en todos los grupos (Figura 4). Previamente en ratas que han demostrado que la tasa de éxito en el número de animales al inicio de HU en comparación con el número de animales que han completado HU sin salir de los aparatos de suspensión (debido a los animales de mascar a través de la cinta de cola de tracción) fue de 10 a de 12, usando la técnica de Morey-Holton 1. Ninguno de los ratones (n = 54) en este estudio que se ha bajado de la suspensión antes de la finalización del período de HU. Lo hicimos sin embargo, tienen un ratón que cola que se desarrolló severamente inflamada. Cuando la inflamación se hizo evidente, hemos eliminado el anillo de la cola para que la zona inflamada para curar, y posteriormente colocó otro anillo de la cola para completar la duración de la HU. En el pasado, cuando se ha utilizado el método de Morey-Holton del HU, por lo general eliminar 1-2 ratones / grupo, ya que salen del aparato de suspensión. Con el método de camino del anillo no hubo episodios de ratones sin querer salir del aparato HU durante el período de HU de 14 o 28 días (n = 54 ratones). <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Cambios de peso corporal (media ± DE). Abreviaturas: CON: levantamiento de peso ratones de control (n = 76), Pre-HU: todos los ratones antes de la HU (n = 54); HU14: extremidades posteriores ratones descargado durante 14 días (n = 34); HU28: miembro posterior descarga de los ratones 28 días (n = 20), REC: ratones miembro posterior descarga permite a la jaula de recuperarse durante 3 días (n = 22). No hubo diferencias significativas en el peso corporal se observaron entre los grupos. <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Sóleo atrofia muscular (media ± DE). Abreviaturas: CON: levantamiento de peso ratones de control (n = 76); HU14: extremidades posteriores ratones descargado durante 14 días (n = 34); HU28: extremidades posteriores ratones descargado durante 28 días (n = 20) y REC: ratones miembro posterior descarga permitidos a la jaula de recuperarse durante 3 días (n = 22). * Significativamente diferente (p &lt;0,001) que el control de carga de peso (CON). δSignificantly diferentes (p &lt;0,01) que los dos grupos HU. 467fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. Consumo de Alimentos (media ± DE). Ingesta diaria de alimentos (g / día) durante el levantamiento de peso y descarga de extremidades inferiores. Abreviaturas: levantamiento de peso ratones de control (n = 76), HU: ratones extremidades inferiores unloaded14 - 28 días. No se observaron diferencias significativas entre los CON y los grupos de HU se observaron. <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Masa suprarrenal (media ± DE). Abreviaturas: CON: levantamiento de peso ratones de control (n = 76); HU14: extremidades posteriores ratones descargado durante 14 días (n = 34); HU28: extremidades posteriores ratones descargado durante 28 días (n = 20) y REC: ratones miembro posterior descarga permitidos a la jaula de recuperarse durante 3 días (n = 22). No se observaron diferencias significativas entre los grupos.

<ol>
	<li>Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+hindlimb+unweighting.">An alternative method for hindlimb unweighting.</a> J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).</li><li>Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+disuse:+a+comparison+of+hindlimb+suspension+and+immobilization.">Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization.</a> J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).</li><li>Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++transients+in+mouse+soleus+muscle+after+hindlimb+unloading+and+reloading.">Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading.</a> Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).</li><li>Morey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+bone+turnover:+correlation+with+a+new+rat+model+of+weightlessness.">Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness.</a> BioScience. 29, 168-172 (1979).</li><li>Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindlimb+unloading+of+growing+rats:+a+model+for+predicting+skeletal+changes+during+space+flight.">Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight.</a> Bone. 22, 83-88 (1998).</li><li>Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindlimb+unloading+rodent+model:+technical+aspects.">Hindlimb unloading rodent model: technical aspects.</a> J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).</li><li>Thomason, D. B., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophy+of+the+soleus+muscle+by+hindlimb+unweighting.">Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting.</a> J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).</li><li>Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+soleus+muscle+myosin+expression+during+hindlimb+suspension+and+recovery.">Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery.</a> J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).</li></ol>

Se evaluó un método alternativo de ratones miembro posterior descarga, lo que nos decidimos a tener mucho éxito. El método de cola de anillo como se describe aquí se utiliza para la suspensión de las extremidades traseras a largo plazo, y estudiar la recuperación después de HU. En cada una de estas condiciones, no hubo evidencia de falta de adaptación como se evidencia por la ingesta de alimentos estable, el peso corporal, y los pesos suprarrenales de los ratones. Esta técnica de cola de anillo HU es fácil de realizar y se pueden incorporar fácilmente con la práctica quirúrgica muy poco. Hay varias ventajas del método de cola de anillo en comparación con el tradicional Morey-Holton 5, 6 método. En primer lugar, la piel y el lugar de la implantación del anillo de la cola que siempre son visibles, por lo que si surgen problemas, es evidente de inmediato, no sólo al final del período de suspensión. En segundo lugar, los animales no son capaces de salir del aparato de suspensión en cualquier momento durante el HU, obviando la necesidad de hacer una determinación de si se debe mantener un ratón o no en el conjunto de datos. Además, los ratones no se molestan en el aparato de anillo y cuando son liberados de HU para la recuperación, no interferir con sus colas, lo que permite una fase de recuperación sin problemas después de HU. Finalmente, los ratones miembro posterior descarga con el método de cola de anillo mantener su peso corporal mejor que los ratones miembro posterior descarga por el Morey-Holton cola de tracción técnica. En nuestras manos después de 14 días de HU se observó una pequeña pérdida (-6,8%), pero no significativa en la masa corporal. Mientras que Ingalls et al. Observaron una disminución significativa -12% del peso corporal en ratones después de 14 días de HU por el método de Morey-Holton 3. Aunque Ingalls no informó pesos suprarrenales, parece que nuestra cola-ring método confiere menos tensión en el ratón (pesos suprarrenales en nuestros ratones HU no son diferentes que en los controles) y un mejor mantenimiento del peso corporal durante el período de extremidades inferiores descarga. En resumen, un método del anillo de la cola de descarga de extremidades inferiores fue desarrollado y probado en ratones HU de 14 y 28 días, y en los ratones volvieron a la recuperación de la jaula de 3 días después de HU. Sobre la base de pesos suprarrenales, la masa corporal y la ingesta de alimentos, los ratones parecen haberse adaptado bien a la cola del aparato de anillo. La extremidad posterior de cola de anillo método de descarga es una alternativa útil, sencilla de la técnica tradicional de Morey-Holton miembro posterior descarga.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Wire cutters/pliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ace Hardware </td>
<td>84-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gauze</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-037-901</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sunbeam</td>
<td>Z-1228-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver nitrate applicators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ARZOL</td>
<td>0001-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane,USP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novaplus</td>
<td>NDC 0409-3292-49</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chlorhexidine Gluconate 4%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Purdue Products L.P</td>
<td>NDC 67618-200-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 2-0 surgical steel suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>SS-28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 X 5/8 A gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Terumo</td>
<td>NN 2516R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostat/ needle holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>12500-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Size 10-24 X 4 machine screws</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hillman The Fastener Center</td>
<td>90272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nylon lock nut size 10 X 24</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hillman The Fastener Center</td>
<td>180141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wing nut size 10 X 24</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hillman The Fastener Center</td>
<td>180243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fender Washer size &frac14; X 1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hillman The Fastener Center</td>
<td>290012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16&#x201D;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bass Pro Shop</td>
<td>38-481-554-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metal sewing machine bobbin.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Singer</td>
<td>45785</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper clip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Depot</td>
<td>221720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2&#x201D; black paper binder clamps.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Depot</td>
<td>308957</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scotch Multi-Use Duct Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Depot</td>
<td>790710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-3/8&#x201D; Plated slotted steel bar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Home Depot</td>
<td>548932</td>
<td>Extends slightly beyond the full length of the cage</td>
</tr>
<tr>
<td>50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alternative Design Manufacturing</td>
<td>RC88D-PC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alternative Design Manufacturing</td>
<td>WB16FS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts, Inc</td>
<td>SWX-4029</td>
<td>U-shaped wire to support water bottle</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

an alternant method to the traditional nasa hindlimb unloading model in mice

El Morey-Holton miembro posterior descarga (HU) es un método ampliamente aceptado Nacional de Aeronáutica y del Espacio (NASA) con base en tierra modelo para el estudio de la atrofia por desuso, en los roedores 4-6. Nuestro estudio se evaluó un método alternante para el estándar de oro Morey-Holton HU-cola tracción técnica en ratones. Cincuenta y cuatro hembras (4-8 meses). HU fueron por 14 días (n = 34) o 28 días (n = 20). La recuperación de la HU se evaluó después de 3 días de deambulación jaula normal después de HU (n = 22). De entre los ratones emparejados (n = 76) sirvieron como controles que soportan peso. Antes de HU un anillo de la cola se formó con un 2-0 de alambre de acero quirúrgico estéril que se ha pasado a través de la 5 ª, 6 ª o 7 ª intervertebral espacio en disco y en forma de un anillo de los ratones que fueron suspendidos. Ubicación vertebral de la cola de anillo fue seleccionado para equilibrar adecuadamente el peso corporal de los animales sin interferir con la defecación. Se determinó el éxito de esta nueva técnica de HU al evaluar el peso corporal antes y después de HU, el grado de atrofia del músculo sóleo y HU masa suprarrenal siguiente. El peso corporal de los ratones antes de la HU (24,3 ± 2.9g) no modificó significativamente descenso inmediatamente después de 14d de HU (22,7 ± 1,9 g), 28d de HU (21,3 + 2,1 g) o después de la recuperación de 3 días (24,0 ± 1,8 g) . La masa del músculo sóleo se redujo significativamente (-39,1%, -46,6% y) después de HU durante 14 días y 28 días respectivamente (p &lt;0,001). Después de 3 días de cobro masivo sóleo significativamente mayor al 74% de los valores de control. Pesos suprarrenales de ratones HU no fueron diferentes en comparación con ratones control. El éxito de nuestro método HU novela se refleja en el mantenimiento del peso corporal del animal, comparable pesos glándula suprarrenal, y la atrofia sóleo siguientes HU, que corresponden a los valores de la literatura esperado 2, 7, 8. Las principales ventajas de este método HU incluyen: 1) la facilidad de examen cola durante la suspensión, 2) disminución de la probabilidad de las colas de cianótico, inflamado, y / o necrótico observado con frecuencia con la cola con una cinta adhesiva y HU, 3) no hay posibilidad de ratones masticando la tracción la cinta y sale del aparato de suspensión, y 4) la recuperación rápida y la actividad normal inmediatamente después de la jaula HU.

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An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

Hemos desarrollado una extremidad posterior alternante descarga modelo en ratones. La principal ventaja de nuestro miembro posterior descarga de cola de anillo sobre el método convencional de Morey-Holton cola de tracción técnica es un procedimiento simple y directo que reduce el estrés en el animal.

Un método de alternante a la modelo tradicional de la NASA Miembro Posterior descarga en ratones

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

an-alternant-method-to-traditional-nasa-hindlimb-unloading-model

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K vistas.  University of Missouri, Columbia. Hemos desarrollado una extremidad posterior alternante descarga modelo en ratones. La principal ventaja de nuestro miembro posterior descarga de cola de anillo sobre el método convencional de Morey-Holton cola de tracción técnica es un procedimiento simple y directo que reduce el estrés en el animal.

Video: An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Investigación

Biología

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Híbrido-Cut: un método de seccionamiento mejorada para muestras de tejido de la planta recalcitrante

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Un método para evaluar los efectos de bacteriocinas en la microbiota intestinal de ratones

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. In vivo cardiac-specific gene delivery is commonly achieved by either systemic or local delivery. Systemic injection via tail vein is easy and efficient in manipulating cardiac gene expression by using recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). However, this method requires a relatively high amount of vector for efficient transduction, and may result in nontarget organ gene transduction. Here, we describe a simple, efficient, and time-saving method of intramyocardial injection for in vivo cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia (without ventilation), the pectoral major and minor muscles were bluntly dissected, and the mouse heart was quickly exposed by manual externalization through a small incision at the fourth intercostal space. Subsequently, adenovirus encoding luciferase (Luc) and vitamin D receptor (VDR), or short hairpin RNA (shRNA) targeting VDR, was injected with a Hamilton syringe into the myocardium. Subsequent in vivo imaging demonstrated that luciferase was successfully overexpressed specifically in the heart. Moreover, Western blot analysis confirmed the successful overexpression or silencing of VDR in the mouse heart. Once mastered, this technique can be used for gene manipulation, as well as injection of cells or other materials such as nanogels in the mouse heart.

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Here we present a protocol for cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia, the mouse hearts were externalized through the fourth intercostal space. Subsequently, adenoviruses encoding specific genes were injected with a syringe into the myocardium, followed by protein expression measurement via in vivo imaging and Western blot analysis.

Un método sencillo y eficaz para la manipulación In Vivo de Gene cardiaco específico por inyección intramiocárdica en ratones

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.

Un Método De Perfusión Anterógrada Para El Aislamiento De Cardiomiocitos De Ratones

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

Imágenes de adhesión molecular en laminación celular mediante ensayo de huella de adhesión

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease is the transplantation of stem cell-derived beta cells. Genetic modifications, however, may be necessary to protect the transplanted cells from persistent autoimmunity. Diabetic mouse models are a useful tool for the preliminary evaluation of strategies to protect transplanted cells from autoimmune attack. Described here is a minimally invasive method for transplanting and imaging cell grafts in an adoptive transfer model of diabetes in mice. In this protocol, cells from the murine pancreatic beta cell line NIT-1 expressing the firefly luciferase transgene luc2 are transplanted subcutaneously into immunodeficient non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (scid) mice. These mice are simultaneously injected intravenously with splenocytes from spontaneously diabetic NOD mice to transfer autoimmunity. The grafts are imaged at regular intervals via non-invasive bioluminescent imaging to monitor the cell survival. The survival of mutant cells is compared to that of control cells transplanted into the same mouse.

This protocol describes a straightforward and minimally invasive method for transplanting and imaging NIT-1 cells in non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient mice challenged with splenocytes purified from spontaneously diabetic NOD mice.

Monitorización bioluminiscente de la supervivencia del injerto en un modelo de transferencia adoptiva de diabetes autoinmune en ratones

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age and overall health status of the patient, failures can occur, leading to delayed union or nonunion. Due to the increasing number of fractures resulting from high-energy trauma and aging, the development of innovative therapeutic strategies to improve bone repair based on the combination of skeletal/mesenchymal stem/stromal cells and biomimetic biomaterials is urgently needed. To this end, the use of reliable animal models is fundamental to better understanding the key cellular and molecular mechanisms that determine the healing outcomes. Of all the models, the mouse is the preferred research model because it offers a wide variety of transgenic strains and reagents for experimental analysis. However, the establishment of fractures in mice may be technically challenging due to their small size. Therefore, this article aims to demonstrate the procedures for the surgical establishment of a diaphyseal femur fracture in mice, which is stabilized with an intramedullary wire and resembles the most common bone repair process, through cartilaginous callus formation.

This protocol describes a surgical procedure for the establishment of a diaphyseal fracture in the femur of mice, which is stabilized with an intramedullary wire, for fracture healing studies.

Establecimiento de un modelo de fractura de fémur diafisario en ratones

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age ...