Este método interrumpe el flujo linfático con un daño mínimo a las células endoteliales linfáticas, y con un control preciso de la sincronización del bloqueo, se puede utilizar para estudiar cómo el flujo linfático afecta a la homeostasis y las respuestas inmunitarias en el ganglio linfático. Ayudar a demostrar el procedimiento será Jingna Xue, una estudiante graduada de mi laboratorio. Para preparar un aparato de inyección, corte aproximadamente 30 centímetros de tubo de polietileno.
Conecte la punta de la aguja A a un extremo del tubo. Desaloje con cuidado otra aguja y conecte el lado roto al otro extremo del tubo de polietileno. A continuación, conecte la aguja A a una jeringa de tuberculina de un mililitro.
Inmediatamente antes de su uso, preparar una mezcla de ketamina-xiazina 10:1 en solución salina. Después de anestesiar el ratón inyectando 250 microlitros de la mezcla de ketamina/xiazina intraperitonealmente, asegurar la anestesia completa con un pellizco de los dedos del dedo. Afeitar el pelaje alrededor de las piernas con cortapelos, luego aplicar crema depilatoria alrededor de la pierna.
Después de cinco minutos, limpie el pelaje residual y la crema depilatoria usando un tejido húmedo, luego limpie la pierna con agua estéril. Rocíe 70% de etanol alrededor de la pierna para esterilizar el área de operación. Coloque el ratón en una posición propensa y utilice cinta quirúrgica para exponer el área de operación en la pierna derecha.
Inyecte intradérgicamente cinco microlitros de 1%Evans de tinte azul, o nueve centímetros del fluido del tubo del aparato de inyección en la almohadilla del pie derecho del ratón. Masajee suavemente el reposapiés para ayudar a que el líquido entre en los vasos linfáticos. Bajo un microscopio diseccionado, localice un sitio de incisión a cinco milímetros del borde inferior de la fosa popliteal.
Usando un par de tijeras, haga una pequeña incisión de aproximadamente cinco milímetros de longitud. Luego usa fórceps de operación fina para estirar la incisión y exponer los vasos linfáticos recolectan. Identificar los dos vasos linfáticos aferentes que conducen a los ganglios linfáticos popliteales.
Con un soporte para agujas, inserte con precaución la aguja de sutura entre los vasos linfáticos aferentes y la arteria safenosa. Tire suavemente de la aguja alrededor de los vasos linfáticos aferentes. Tire con cuidado de la cuerda de sutura, dejando alrededor de dos centímetros de la cuerda de sutura detrás.
Utilice el soporte de la aguja para ayudar a atar el nudo de un cirujano. Masajee suavemente la almohadilla para los pies para asegurarse de que ningún tinte azul Evans pase el sitio de la sutura, luego corte la cuerda sobrante con tijeras. Suturar los otros vasos linfáticos aferentes, luego cerrar la incisión de la piel con la misma sutura que se utilizó para los vasos linfáticos.
Para el control falso, inyectar indestro veces cinco microlitros de 1%Evans tinte azul en la almohadilla del pie izquierdo, y masajear la almohadilla de pie. Abra la piel con una incisión y luego cierre la herida sin suturar el vaso. Al monitorear el ratón después de la cirugía, la pierna derecha debe mostrar edema, con tinte azul Evans extendiéndose al muslo, mientras que la pierna de control mostrará el tinte azul Evans restringido a la almohadilla del pie.
Inmediatamente después de la cirugía, inyectar indestro como intradérgicamente 10 microlitros de 2%FITC tanto en la almohadilla derecha como en la izquierda. Dos, seis y 12 horas después de la inyección de FITC, recoger los ganglios linfáticos popliteales de la fosa de ratones eutanizados. Retire cuidadosamente el tejido adiposo perinodal alrededor de los pLN.
Incruste los pLN en un compuesto de temperatura de corte óptimo con el área medular del seno orientada al lado del molde criogénico. Usa un criotomo para preparar secciones congeladas de 20 micras. Para determinar la distribución fitC en los pNN, imagine las criosecciones bajo un microscopio confocal.
Las imágenes confocales capturadas dos, seis y 12 horas después de la inyección de FITC muestran una acumulación de FITC sustancialmente reducida en los ganglios linfáticos popliteales después de suturar los vasos linfáticos aferentes. El FITC residual en los pNN se acumuló preferentemente en los senos paranasales de los ganglios linfáticos. Las imágenes confocales del tejido adiposo perinodal muestran cuando los vasos linfáticos están bloqueados por sutura, FITC entra en el tejido cuando el ganglio linfático senos paranases, pero no se distribuye eficazmente a través de los ganglios linfáticos.
Al intentar este método, es importante recordar que insertar la aguja de sutura entre el vaso sanguíneo y el vaso linfático es fundamental. El fracaso de este paso puede romper los vasos. Después de realizar este método, es posible inmunizar a los ratones con infección u otra estimulación inmune para estudiar cómo el flujo linfático regula la protección inmune.
La función del flujo linfático no se entiende bien. Este método se puede utilizar para estudiar las migraciones celulares en el ganglio linfático en ausencia de flujo linfático.
