El campo de la vesícula extracelular ha carecido de un modelo de invertebrado genéticamente tratado para estudiar las señales de proteínas y ARN de las vesículas extracelulares. Este protocolo establece los métodos para obtener vesículas extracelulares abundantes y puras de C.elegans. Esto es suficiente para un análisis robusto de ARN-SEQ y proteómico.
Cuando el cultivo sincronizado C.elegans ha agotado los alimentos de su placa media de crecimiento normal, utilice bandas de goma para fijar una tapa de filtro de malla de nylon de cinco micrómetros en una botella estéril y comenzar un vacío. Vierta los gusanos L1 en el filtro y pase un volumen igual de medio sobre los agregados de gusanos. Después del vórtice, transfiera tres volúmenes de 10 microlitros de la suspensión del gusano a una tapa de la placa de cultivo de gusanos y cuente el número de animales en cada gota.
Ajuste la suspensión del gusano a dos animales por microlitro de medio fresco y vórtice la suspensión de nuevo. A continuación, agregue nueve, 10 microlitros de gusanos en una nueva tapa de placa y cuente manualmente el número de animales en cada gota. A continuación, calcule la media y el error estándar de la media como un porcentaje de cada población de gusanos y calcule el número total de animales en cada población.
Para preparar los gusanos para la generación de secretomas, lave los gusanos con tres lavados de cinco minutos en 15 mililitros de medio estéril M9 con 50 microgramos por mililitro de carbenicillina por placa por lavado con suave remolinos para desalojar los gusanos, agrupando los lavados en un tubo cónico de 50 mililitros. Después del último lavado, diluir los gusanos a un animal por microlitro de solución de S-Basel complementado con 2,5 microgramos por mililitro de colesterol y 50 concentración de carbenicillina micromolar. A continuación, agregue hasta 400 mililitros de la suspensión del gusano a un matraz estéril de dos litros deflector inferior.
Coloque el matraz en un rotador circular a 20 grados Centígrados y 100 rotaciones por minuto durante 24 horas. Para la cosecha de vesícula extracelular, transfiera los gusanos en un tubo cónico de 50 mililitros para centrifugación y decante el sobrenadante a través de un filtro de vacío de 0,22 micrómetros para eliminar cualquier desecho de partículas. Después de contar, coloque una gota de gusanos suspendidos en un césped bacteriano y anote a los animales como en movimiento, paralizado o muerto después de 15 minutos.
A continuación, concentre el sobrenadante filtrado en 700 microlitros con un filtro de corte de peso molecular de nitrocelulosa regenerada de 10 kilodalton y añada 150 microlitros de solución S-Basel fresca a la reducción. Filtre y vórtice la solución resultante y repita la reducción y filtración dos veces más como se acaba de demostrar. Después de la última filtración, centrifugar el sobrenadante para eliminar las partículas y residuos que se hayan acumulado durante la manipulación y añadir el cóctel inhibidor de la proteasa más EDTA según las instrucciones del fabricante.
Para preparar la columna de exclusión de tamaño, decante 15 mililitros de resina de agarosa suspendida en un cartucho de columna de flujo de gravedad vacío. Cuando la columna haya drenado, añada la solución S-Basel hasta que el lecho de resina se empaque a un volumen final de 10 mililitros. Sustituya el tampón de resina por 40 mililitros de solución estéril filtrada de S-Basel, teniendo cuidado de no molestar la resina y permita que la gravedad drene el tampón a través de la columna.
Una vez que la parte superior de la resina ya no esté sumergida, cubra la parte inferior del cartucho para detener el flujo y coloque un tubo de recogida debajo de la columna. Para iniciar el fraccionamiento secretoma, quite la tapa e añada inmediatamente la solución de secretomo concentrada en la parte superior del lecho de columna, seguido de la adición de un mililitro de solución de S-Basel por gota. Coloque un tubo de recogida fresco debajo de la columna y llene lentamente el depósito de la columna superior con cinco mililitros de solución S-Basel.
Después de recoger los dos primeros mililitros de eluido, cambie rápidamente los tubos para recoger los siguientes cuatro mililitros. Utilice un filtro de centrifugado de peso molecular regenerado de nitrocelulosa de 10 kilodalton para concentrar la vesícula extracelular que contiene eluido de columna a 300 microlitros y transferir el filtro retentate a un tubo de microcentrífuga de baja unión. A continuación, lave la membrana del filtro dos veces con 100 microlitros de solución S-Basel a los 20 segundos de vórtice por lavado y combine los lavados con el retentado original para un volumen final de muestra de 500 microlitros.
Para preparar las vesículas extracelulares para la cuantificación mediante análisis citométrico de flujo, añada 840 microlitros de solución S-Basel y 60 microlitros de vesículas extracelulares purificadas a un tubo de microcentrífuga. Agregue 300 microlitros de la muestra en dos tubos de microcentrífuga adicionales junto con siete microlitros de una sonda potenciométrica adecuada por tubo. Añadir siete microlitros de 1%Triton X-100 al último tubo y mezclar todos los tubos por vórtice.
Coloque una punta sonicadora en el centro del tubo de la tercera muestra y pulse la muestra 10 veces a una potencia del 20% y un ciclo de trabajo del 30%. A continuación, añada 300 microlitros de solución S-Basel a dos tubos de microcentrífuga de control y añada siete microlitros de sonda al tubo de colorante. Etiquete el segundo tubo Tampón solamente.
A continuación, incubar todos los tubos durante una hora a temperatura ambiente protegidos de la luz antes de su análisis por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar. Para analizar los datos, abra los archivos en el software de análisis citométrico de flujo adecuado. Establezca una puerta rectangular comenzando en la parte superior de la parcela que se extiende desde el nivel de dispersión de luz de ángulo pequeño en un momento 10 a los dos a uno por 10 a los cuatro y derribando la puerta hasta que contenga alrededor del 2,5% del total de eventos.
Asigne un nombre a la puerta después de la sonda y copie y pegue la puerta en las otras dos gráficas de datos de muestra y control. A continuación, exporte el análisis a una hoja de cálculo. Aquí, se muestran los resultados representativos de 10 réplicas biológicas.
La variabilidad entre réplicas no es significativa y el error estándar típico de la media del tamaño de la población es un poco más del 10%La transferencia de animales entre placas resulta en alrededor de un 10% de pérdida de animales, mientras que alrededor del 20% de los animales se pierden en el paso de flotación de sacarosa. En promedio, 1.000 animales adultos jóvenes de tipo salvaje secretarán un microgramo de proteínas de más de 10 kilodaltones en su entorno. Cuando esta fracción se separa aún más por la cromatografía de exclusión de tamaño, el perfil de elución de proteína total demuestra un pequeño pico de proteína entre dos y seis mililitros y un pico grande después de ocho mililitros.
Las vesículas extracelulares están contenidas dentro de los primeros cinco mililitros de la columna eluido. En una comparación directa de las características de citometría de flujo entre C.elegans y vesículas extracelulares humanas, un histograma de eventos de muestra de vesícula extracelular C.elegans, ordenados por dispersión de luz de ángulo pequeño, muestra que todas las preparaciones alcanzan una intensidad media de fluorescencia de aproximadamente una vez 10 a la tercera. La sonda potenciométrica DI-8-ANEPPS, etiqueta robustamente las vesículas extracelulares C.elegans y la abundancia de vesículas extracelulares purificadas ordenadas por la expresión DI-8-ANEPPS no es significativamente diferente entre C.elegans y preparaciones derivadas del cultivo celular.
Las muestras preparadas por este procedimiento son susceptibles de todos los métodos típicos de análisis de vesículas extracelulares aguas abajo, incluyendo ARN-SEQ, citometría de flujo, análisis de seguimiento de nanopartículas y análisis proteómico. El establecimiento de métodos para purificar las vesículas extracelulares C.elegans permite a los investigadores utilizar este sencillo modelo de invertebrados para estudiar las vías genéticas y los procesos fisiológicos que afectan la composición de la carga de vesículas extracelulares.
