Este protocolo proporciona PDAC in vivo reproducibles e inmunocompetentes adecuados para estudios de genotipo, fenotipo y respuesta a fármacos. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para ayudar a investigar la progresión tumoral con un microambiente tumoral biológico singénico mientras mantiene la reproducibilidad del experimento. Demostrando el procedimiento estarán Stefanie Barthel y Chiara Falcomata, ambas de nuestro laboratorio.
Comience la preparación de las células tumorales lavando el adenocarcinoma ductal pancreático, o células PDAC, cultivadas en un matraz de cultivo T75 con solución salina tamponada con fosfato o PBS. Luego agregue 0.5 mililitros de tripsina durante cinco a 10 minutos para separar del matraz. Vuelva a suspender las células desprendidas en 10 mililitros de DMEM con 10% de suero bovino fetal, o FBS, y estreptomicina de penicilina al 0,1% antes de transferir la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.
Centrifugar la suspensión celular a 200G durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en DMEM sin aditivos, en función de la concentración final requerida de las células para inyección. Cuente las células en 10 microlitros de suspensión celular, utilizando la Cámara Neubauer y calcule el número de células disponibles.
Transfiera un mililitro de la suspensión diluida, según la concentración final requerida, a un tubo de 1.5 mililitros. Coloque el tubo en un rotador hasta la implantación para evitar la agregación celular. Para la implantación ortotópica de células PDAC, aplique crema para los ojos al ratón analgosedado mientras el ratón está durmiendo.
Compruebe la analgosedación suficiente antes de afeitarse el flanco abdominal lateral izquierdo del ratón analgosedado. Coloque el ratón, acostado sobre el lado derecho, sobre una estera calefactora estéril y pegue las patas a la superficie. Use guantes nuevos y desinfectarlos.
Usando tijeras quirúrgicas, corte aproximadamente un centímetro de la piel y el tejido graso subcutáneo longitudinalmente en el flanco izquierdo donde se proyecta el bazo. Usando tijeras y fórceps, separe la piel del peritoneo para obtener un acceso más fácil al peritoneo. Cambie el par de tijeras antes de abrir el peritoneo en la ubicación del bazo con un corte longitudinal de un centímetro.
Al movilizar el bazo y el páncreas adjunto con fórceps romos y de punta fina, asegúrese de que los órganos no estén unidos a otro tejido. También verifique los vasos sanguíneos suministradores para evitar lesionar los vasos o el tejido circundante al manipular el páncreas. Tire cuidadosamente del páncreas de la incisión para permitir un acceso más fácil a la cola del órgano y observe el bazo siguiendo el páncreas.
Asegúrese de que el órgano no esté doblado durante la inyección y que la cápsula del órgano se mantenga bajo tensión en el sitio de penetración de la aguja para evitar derrames. Apunte a un pedazo de tejido pancreático entre los vasos sanguíneos visibles para minimizar el riesgo de perforar o inyectar el vaso. Usando la mano dominante, penetre cuidadosamente la cápsula del órgano con una cánula de calibre 27 y una jeringa de 50 microlitros siguiendo el eje longitudinal del órgano.
Después de inyectar los 20 microlitros de suspensión que contienen 2, 500 células en el área de la cola del páncreas, mantenga el páncreas y la jeringa insertada quietos durante aproximadamente un minuto para evitar derramar las células tumorales. Luego, retire la aguja del sitio de inyección. A continuación, reorganice cuidadosamente los órganos dentro del abdomen sin dañar el tejido para evitar derramar las células.
Evite la adhesión de órganos vertiendo un mililitro de cloruro de sodio al 0,9% en los órganos. Después de suturar el peritoneo con la técnica de sutura interrumpida simple, cierre la piel con dos o tres clips de acero inoxidable de nueve milímetros. Luego antagoniza la analgosedación con midazolam, medetomadina y fentanilo, o MMF, con una inyección subcutánea de AFN de acuerdo con el peso corporal del ratón.
Una vez hecho esto, coloque el ratón en una cámara calentada a 37 grados centígrados hasta que esté despierto y completamente activo. Vuelva a colocar el ratón activo en su jaula original y controle el estado de salud del ratón comprobando el pelaje, el color de la piel y la actividad, y repítalo tres o cuatro horas después de la cirugía. En la resonancia magnética de ratón implantado, el injerto de células PDAC se palpó abdominalmente más temprano aproximadamente siete días después de la cirugía, dependiendo del número de células inyectadas y las características de agresividad y crecimiento de la línea celular inoculada.
La supervivencia de los ratones implantados resultantes varió dependiendo de las características intrínsecas de las células tumorales de las líneas celulares. Las inyecciones intrapancreáticas exitosas condujeron a tumores en toda regla en el páncreas del ratón. Por el contrario, los implantes fallidos dieron lugar a la ausencia de tumores pancreáticos debido a la inyección de células no viables, el rechazo de las células implantadas o la inyección de un número insuficiente de células.
Recuerde prestar atención a no derramar ninguna célula durante las inyecciones y no dañar ningún tejido circundante para evitar que las células se propaguen dentro del abdomen. Después de este procedimiento, se pueden realizar estudios in vivo, como estudios preclínicos de respuesta a medicamentos, en ratones inmunocompetentes, seguidos, por ejemplo, de hechos, secuenciación o análisis histológico para investigar las interacciones del huésped tumoral.
