Este método permite analizar la barrera hematoencefálica humana midiendo el traversal bacteriano en diferentes tratamientos. Puede ayudar a descubrir la patogénesis de la meningitis bacteriana y delirio postoperatorio. Es un método sencillo y los efectos del tratamiento están representados directamente por el número de bacterias.
Se puede modificar para permitir un análisis de alto rendimiento de compuestos en las células endoteliales. Comience por ensamblar la placa de 12 pozos en un armario de seguridad biológica. Desembale la placa y cada plaquita, luego use fórceps esterilizados para agarrar las plaquitas en su base y ponerlas en los pozos.
Recubrir la membrana porosa de cada plaquita con 90 microlitros de 10 microgramos por microlitro colágeno IV y mezcla de fibronectina e incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius durante 24 horas. Después de la incubación, lave las plaquitas dos veces pipeteando un mililitro de PBS en cada plaquita y aspirando con una bomba de vacío. A continuación, equilibre las membranas pipeteando el medio DMEM F12 precalentado en las cámaras superior e inferior e incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Para sembrar las células endoteliales microvasculares humanas, aspirar el medio del matraz de cultivo celular y lavar las células con 10 mililitros de PBS. Cubra las células completamente con cinco mililitros de trippsina EDTA e incubar el matraz durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Transfiera cinco mililitros de las células a un tubo de 15 mililitros y agregue cinco mililitros de FCS que contengan un medio para detener la reacción enzimática.
Centrifugar la suspensión durante tres minutos a 210 veces g, quitar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en cinco mililitros de medio. Añadir 10 microlitros de la suspensión celular a 10 microlitros de 0.4%trypan mancha azul, luego añadir 10 microlitros de la mezcla a una cámara de conteo. Coloque la cámara de conteo en el contador de celdas e inicie el programa adecuado asegurándose de que el contador esté enfocado.
Después de contar, sembrar 200.000 células en cada cámara superior en la placa de 12 pozos e incubar la placa a 37 grados Cent celsius durante 14 días cambiando los medios en la cámara superior e inferior cada dos a tres días. Después de 14 días, asegúrese de que la confluencia celular sea 100% mediante imágenes con un microscopio. Un día antes de la medición de la permeabilidad, poner una colonia de cepa de E.coli GM2163 en tres mililitros de medio LB.
Cultivo de las células a 37 grados Celsius durante 24 horas en un agitador de incubación. Para tratar las células con un compuesto de interés, diluirla a su concentración final en el medio DMEM F12 y añadir esta mezcla en las cámaras superior e inferior en la placa de 12 pozos, luego incubar la placa en una incubadora de cultivo celular. Después de la incubación, cambie el medio completo por medio libre de antibióticos.
Determinar la concentración del cultivo bacteriano durante la noche midiendo su densidad óptica a 600 nanómetros, luego diluirlo a un OD600 de 0.5 en un tubo Falcon de 50 mililitros. En un gabinete de seguridad biológica, agregue 450 microlitros de la solución bacteriana en cada cámara superior de la placa de 12 pozos, luego incubar la placa durante seis horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire el inserto con fórceps y muestree 50 microlitros del medio de cada cámara inferior teniendo cuidado de no derramar el medio de las cámaras superiores en las inferiores.
Es importante separar estrictamente los medios de la cámara superior e inferior, ya que un derrame de bacterias de la cámara superior conduciría a resultados falsos positivos. Suelte cada muestra en una placa de agar separada y raye la solución con un esparcidor celular. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas, luego contar las colonias.
Para investigar el efecto de la glicación en el traversal microbiano a través de la barrera hematoencefálica, las células se trataron con una solución de glioxal de 0,5 y 0,15 mililitrolares durante una hora con células no tratadas que sirven como control. La glicación se detectó entonces a través de inmunoblotting con anticuerpos anti-AGE. Las colonias bacterianas obtenidas fueron contadas y representadas como el número absoluto de colonias o el número relativo de colonias normalizadas al control.
Las muestras tratadas con glioxal mostraron un mayor número de colonias que indicaron que el tratamiento tiene un efecto sobre la densidad de la barrera celular. Para investigar la glicación proteica inducida por glucosa, se cultivaron THBMECs en glucosa normal y medio de glucosa alto. El número absoluto de colonias y el número relativo de colonias normalizadas al control indicaron que la glucosa no tuvo ningún efecto significativo en la integridad de la barrera hematoencefálica.
Las células endoteliales tratadas se pueden analizar más a fondo mediante enfoques proteómicos, por ejemplo espectrometría de masas, para analizar los cambios en el proteomo. Esta técnica ayuda a entender la barrera hematoencefálica humana y el travesancia bacteriana. Se puede utilizar para descubrir aspectos del envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer.
