Este trabajo fue apoyado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), células en movimiento Cluster de Excelencia (EXC 1003 - CIM), de la Universidad de Münster (a SB y SGM) y por lo demás el Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 a SB y SGM). Damos las gracias a Heike Blum por las excelentes ilustraciones.

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por las autoridades locales (&quot;LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz; Recklinghausen, Alemania&quot;) y llevaron a cabo de acuerdo con la ley alemana de protección de los animales. 1. Comentarios generales para experimentos con ratones <ol><li> Lleve a cabo todos los experimentos con ratones de acuerdo con las directrices del Comité de Animales Institucional de Cuidado y Uso respectivo. </li><li> Mantenga los ratones en condiciones libres de patógenos y que puedan tener acceso a alimentos y agua ad libitum. </li><li> Utilice ratones por edad y sexo en los grupos experimentales ya que las propiedades biológicas pueden variar con la edad y el género. </li><li> Siempre que sea posible tratar de reducir, refinar o sustituir los experimentos con animales. </li></ol> 2. Preparación del gradiente de Percoll <ol><li> Mezclar 19 ml de 1x PBS con 1 ml de 10x PBS, 1 ml de FCS y 10 ml de Percoll. </li><li> Realizar steirritar a la filtración en un tubo de vidrio (diámetro de los poros del filtro: 0,2 micras). Después almacenar la solución a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparación de Medio endotelio celular y revestimiento de placas de cultivo celular <ol><li> Medio celular endotelial: <ol><li> Preparación del medio de 500 ml: (aprox. 20%) Mezclar 400 ml de DMEM medio (aprox. 80%) con 100 ml PDS, 0,25 ml de bFGF (. 20 mg / ml; aprox 0,05%), 0,5 ml de heparina (100 l / ml; aprox. 0,1%) y 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml; aprox. 0,1%). Añadir pyrumycin sólo para medio de cultivo celular utilizado en los primeros 2 días de cultivo. </li><li> Realizar la filtración estéril en un tubo de vidrio (diámetro de poros del filtro: 0,2 m). Después almacenar la solución a 4 ° C. </li></ol></li><li> Recubrimiento de placas de cultivo celular: <ol><li> Para 1 ml de solución de recubrimiento, preparar una solución de 500 l ddH 2 O, 400 l de colágeno IV (0,4 mg / ml) y 100 l de fibronectina (0,1 mg / ml). </li><li> Cubra toda la superficie de la CAOh pocillo de la placa de cultivo celular con la solución de recubrimiento. Guarde la placa a 4 ° C durante la noche. </li></ol></li></ol> 4. Aislamiento de células endoteliales microvasculares de cerebro murino (MBMEC) <ol><li> Sacrificio 10 ratones adultos (8 - 12 semanas de edad, C57BL / 6) por dislocación cervical. Después de aislar el ratón-cerebros y tienda en 5 ml de PBS (Advertencia: El trabajo estéril). </li><li> Retire cerebro tallos, cerebelo y tálamo con un fórceps. Separe las meninges enrollando cuidadosamente el cerebro en un papel secante estéril. Recoge las meninges prosencéfalos libres resultantes. </li><li> Transfiera los cerebros a un tubo Falcon de 50 ml llena de 13,5 ml de DMEM. </li><li> Picar el tejido, primero con una pipeta de 25 ml, a continuación, con una pipeta de 10 ml hasta que el medio se vuelve lechoso. </li><li> Entonces digerir el tejido con una mezcla de 0,6 ml de colagenasa CLS2 (10 mg / ml en DMEM) y 0,2 ml de DNAsa (1 mg / ml en PBS) en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) durante 1 hora a 37 ° C en un orbital sacudirr a 180 rpm. </li><li> Añadir 10 ml de DMEM añaden a la suspensión de tejido y centrifugar las células a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Descartar el sobrenadante (Advertencia: PELLET es fácil perder) </li><li> Para quitar la mielina, resuspender el precipitado con una pipeta de 25 ml en 25 ml de BSA-DMEM (20% w / v) (aprox. 25 veces), y se centrifuga a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Desechar la capa de mielina superior (lechosa) con una pipeta Pasteur de vidrio rota con mayor diámetro, y luego desechar la capa de BSA con una pipeta Pasteur normales. </li><li> Resuspender el precipitado en 9 ml de DMEM y se añade 1 ml de colagenasa / dispasa (concentración final es 1 mg / ml) y 0,1 ml de DNAsa. Digerir la solución durante 1 hora a 37 ° C en un agitador orbital a 180 rpm (advertencia: no utilice la pipeta para volver a suspender - las células se pueden perder). </li><li> Durante la digestión, centrifugar la solución de Percoll para establecer el gradiente de densidad usando una ultracentrífuga a 3.000 xg durante 1 hora a 4 ° C, con una aceleración, wifreno sn. </li><li> Añadir 10 ml de DMEM a la suspensión celular digerido. Se centrifuga la suspensión a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. A continuación, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 ml de DMEM. </li><li> Añadir las células resuspendidas cuidadosamente en la parte superior del gradiente de Percoll y se centrifuga a 700 xg durante 10 min a 4 ° C sin aceleración y freno. Nota: Las células son visibles como una nube en la interfase. </li><li> Tome aprox. 12 ml de la interfase con las células con una aguja estéril largo y colocarlo en un nuevo Falcon de 50 ml con 5 ml de DMEM. </li><li> Centrifugar las células de nuevo a 1.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Después resuspender el precipitado en medio de células endoteliales (utilizar aprox. 0,2 ml de medio por 1 cm 2 de superficie de placa de cultivo celular). </li><li> Retire solución de revestimiento de placas de cultivo celular recubiertas (consulte el paso 3.2) y enjuagar bien con todos PBS estéril en dos etapas de lavado consecutivos. </li><li> Mantener cultivos celulares in endotelialmedio celular a 37 ° C y CO 2 en un incubador estéril al 5%. Cambiar el medio cada dos o tres días. Dividir celdas en el 90% de confluencia. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Disfunción sangre-cerebro-barrera es una característica de diversas enfermedades del SNC deletéreos, por ejemplo, un desglose de la BBB en la esclerosis múltiple facilita ampliamente la invasión del SNC por células inmunes autorreactivas y permite el encuentro y la destrucción de los oligodendrocitos. En el accidente cerebrovascular isquémico la interrupción de la BBB y la subsiguiente formación de edema cerebral son factores críticos que influyen en el crecimiento del infarto secundaria y la supervivencia global de los pacientes 6. Además, por alteraciones de la BBB en áreas remotas lesiones isquémicas focales son capaces de inducir alteraciones funcionales generalizadas del cerebro. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes son en gran medida desconocidos 5. En contraste, la alta densidad y diversidad de transportadores de eflujo en BMECs funcionales reduce la concentración de fármacos beneficiosos tales como agentes quimioterapéuticos para neoplasias cerebrales o antibióticos para enfermedades infecciosas. Por lo tanto, una comprensión más profunda del cerebro-sangre-barSe requiere portador función en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas para desarrollar agentes farmacológicos que son capaces de regular específicamente la función de barrera en la dirección favorecida 21. Pronóstico en modelos in vitro de la acreditación son herramientas indispensables para el estudio de los mecanismos de regulación de la acreditación. Muchas líneas de células endoteliales inmortalizadas cerebro se han establecido y empleado como modelos in vitro de BBB 22. Estas líneas celulares ofrecen ciertas ventajas sobre BMECs primarias a medida que crecen más rápido y mantienen ciertas características de BBB durante varios pasajes. Sin embargo, las líneas de células endoteliales no pueden sustituir completamente a las células primarias propiedades importantes como son cambiadas que se entremezclan con la transferibilidad de los resultados experimentales a la situación in vivo. Por ejemplo, la línea de células endoteliales del cerebro murino bEnd.5 expresa sólo bajos niveles de proteínas apretado nudo distribuidos de manera discontinua que conducen a alta Paracpermeabilidad ellular 23. BEnd.3, otra línea de células endoteliales del cerebro murino utilizado con frecuencia, demuestra uniones densas y continuas distribuidas ajustados, una alta resistencia transendotelial, varios transportadores de salida y baja permeabilidad paracelular. Sin embargo, las capas de células bEnd.3 en comparación con BMECs primarias carecen de una verdadera discriminación con respecto a la permeación de cierta transcelular y paracelular 24 sustratos. En las preparaciones de cultivos de células primarias, células contaminantes pueden interferir significativamente con la validez de los resultados experimentales. En el protocolo descrito, pyrumicin se utiliza como un agente selectivo para las células endoteliales para lograr alta pureza. Sin embargo, un control de calidad regular del cultivo celular está inevitablemente necesario para garantizar para los experimentos fiables. Hay varios métodos para el control de calidad, además de propiedades morfológicas típicas de las células endoteliales (véase la Figura 1A), el transendothelial resistencia podría medirse o la expresión de marcador de células endoteliales tales como CD31 (véase la figura 1B) o el factor de von Willebrand (vWF) podría ser evaluado. El número de células endoteliales cerebrales aisladas a partir de un cerebro de ratón es relativamente baja y para establecer un cultivo celular adecuado para múltiples experimentos, los cerebros de varios ratones tienen que ser agrupado. En nuestra experiencia, al menos 10 ratones necesitan ser utilizado para un experimento que podría ser un factor limitante en función de los recursos de la instalación animal respectivo. Con el fin de evitar sesgos o factores de confusión, sólo los ratones con un fondo genético y ambiental idénticos deben ponerse en común. En contraste, bovino y preparaciones de células endoteliales de cerebro porcino proporcionan un gran número de células endoteliales de cerebro disponibles en una sola cerebro. Sin embargo, además de la cría y la vivienda no complicada, el amplio y creciente repertorio de ratones transgénicos disponibles hace murino primaria BMECs como un idealmodelo para el estudio de la función de la sangre-cerebro-barrera. Varios hallazgos clave relativos a las funciones de la acreditación y los mecanismos moleculares subyacentes han venido de los estudios en los sistemas de cultivo de tejidos en 2D. Recientemente, los sistemas de cultivo 3D se han desarrollado 25, donde las células endoteliales se colocan dentro de una matriz de colágeno lo que les permite formar lumen y redes tubulares. Estos nuevos sistemas de cultivo celular permiten una reproducción más precisa de los procesos vasculares en el organismo intacto in vivo. La participación de otras células de los NVU en 3D sistemas de cultivo celular, tales como los pericitos y astrocitos podría revolucionar el estudio in vitro de la función sangre-cerebro-barrera; primeros modelos Recientemente se han desarrollado 26. Hay algunas recomendaciones para la solución de problemas. En primer lugar de trabajo estéril es esencial para la calidad del cultivo celular endotelial. En segundo lugar, pyrumycin sólo se debe agregar para celularmedio de cultivo utilizado en los primeros 2 días de cultivo, la aplicación más larga podría conducir a un aumento de la muerte celular y la función MBMEC barrera baja calidad. En tercer lugar, las enzimas aplicadas en este protocolo deben ser utilizados y almacenados de acuerdo con las instrucciones del fabricante; de lo contrario su función apropiada podría verse comprometida. Además, el revestimiento de placas de cultivo celular puede ser modificado si las células endoteliales no se adhieren. Las concentraciones de fibronectina y colágeno pueden ser cambiados u otras proteínas de la matriz pueden ser añadidos a la solución de revestimiento. Por último, la edad, el género, la temporada de las condiciones ambientales dentro de año y la instalación de animales son factores importantes que pueden influir en la calidad de aislamiento MBMEC y comparabilidad de los experimentos. Asimismo, debe asegurarse de que las condiciones son comparables entre experimentos independientes. El protocolo descrito debe considerarse como un método para aislar neuroinmunológicas básica BMECs murinos. Las células aisladas pueden ser used para una amplia variedad de aplicaciones para obtener una mayor comprensión de la acreditación función, tal como ensayos de migración, gen y estudios de expresión de proteínas, evaluaciones electrofisiológicas o experimentos de permeabilidad. Como se mencionó anteriormente, los sistemas de cultivo de células en 3D de BMECs podrían proporcionar nuevas oportunidades para estudiar los complejos mecanismos implicados en la regulación de la acreditación en el contexto de la NVU. Por lo tanto, el aislamiento de células endoteliales primarias seguirá siendo una técnica muy valiosa en el campo de la acreditación de investigación en el futuro.

<html> Microvascular del cerebro las células endoteliales (CEMB) monocapas de forma que son una parte integral de la barrera sangre-cerebro-barrera altamente especializado (BBB). BMECs están interconectados por las proteínas de unión unidos a una membrana basal. Junto con los pericitos, células del músculo liso, pies finales astrocytic y las células sanguíneas circulantes se acumulan la llamada unidad neurovascular (NVU) 1. Contra la noción anterior de una barrera impermeable entre la sangre y el sistema nervioso central (CNS), el NVU es una interfaz dinámica y altamente específico y regulado que controla la transición de fluidos, moléculas y células entre los vasos sanguíneos cerebrales y del sistema nervioso central 2 . Una disfunción o desregulación de la NVU pueden iniciar y / o contribuir a una variedad de neurovasculares, enfermedades infecciosas, inflamatorias o degenerativas del SNC, tales como accidente cerebrovascular isquémico, el VIH-encefalopatía, la esclerosis múltiple, de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson 3-6. _content &quot;&gt; La monocapa BMEC está cerrado herméticamente por un complejo de unión constituido de apretado (TJ) y uniones adherentes (AJ) 7. La alta resistencia eléctrica y la baja permeabilidad paracelular de la acreditación se basan principalmente en las proteínas TJ 8. Los TJs son complejos formados por las proteínas transmembrana de la familia claudin y ocludina, que están vinculados al citoesqueleto de las células endoteliales de moléculas adaptadoras, como los zonulaoccludens (ZO) proteínas ZO1-3 4. las uniones adherentes se ensamblan principalmente por la proteína integral de la membrana endotelial (VE) -cadherin vascular, que está vinculado al citoesqueleto a través de cateninas 8. El cierre hermético de la acreditación impide el libre intercambio de sustratos y células entre la sangre y el líquido cefalorraquídeo. Las excepciones a esta regla son lipofílicas, pequeñas moléculas con un peso molecular &lt;400 Da, que son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica por mediada por lípidos difusión 9. El paso del más grande y / omoléculas hidrófilas, tales como glucosa, aminoácidos, péptidos, proteínas y muchos fármacos se limita a sistemas altamente controlados transcelular de transporte 10, que pueden clasificarse en cinco categorías principales: transporte mediado por portador, el transporte de iones, el transporte de expulsión activa, mediada por los receptores transporte, y caveolae mediada por el transporte 4. Estos sistemas de transporte ayudan a mantener la homeostasis del SNC, que se requiere para una generación de señal precisa, la transducción y la integración. Por otra parte, BMECs son capaces de controlar activamente la transición de moléculas diferentes por la expresión de una variedad de ectoenzimas. Estas enzimas se localizan en la superficie celular y modificar sustratos endógenos y exógenos específicos impidiendo o permitiendo la transición de la acreditación 11. Considerando que el SNC era considerado como un órgano inmunológicamente privilegiado para un largo tiempo, los recientes hallazgos sugieren un sistema más dinámico y bien regulado de una vigilancia inmuneha ejercido una vigilancia de la CNS. Los BMECs están críticamente involucradas en la regulación de la transmigración de las células inmunitarias. Por la expresión de selectinas en sus linfocitos de superficie son inducidas selectivamente para acoplar con flojedad al endotelio. La secreción de quimiocinas que se enfrentan con receptores específicos en los leucocitos conduce a la expresión o los cambios conformacionales de las integrinas de leucocitos, tales como LFA-1 (antígeno asociado a la función linfocitaria-1) y VLA-4 (antígeno muy tardío-4). Las integrinas median una adhesión firme mediante la unión de sus contrarreceptores endoteliales, por ejemplo VCAM-I (molécula de adhesión celular vascular), ICAM-I (molécula de adhesión intercelular) que permiten la transmigración en el parénquima cerebral o entre a través de la BBB BMECs 12-14. Estos y otros hallazgos subrayan el papel activo del propio endotelio en la regulación de la migración de células inmunes. Por otra parte, BMECs como parte del NVU están involucrados en la regulación de la li flujo sanguíneo cerebralnked a las demandas metabólicas neuronales locales. Tras la estimulación de los astrocitos células endoteliales producen sustancias vasoactivas como el óxido nítrico que conduce a la relajación de las células musculares lisas vasculares 15. La angiogénesis y la neurogénesis en el desarrollo, así como en el adulto cerebro muestran patrones y el desarrollo paralelo y compartir muchas de las propiedades de la regla 1, 4. Las células endoteliales están implicadas críticamente en estos procesos 16, 17. En resumen, BMECs proporcionan características esenciales para garantizar un correcto desarrollo y funcionamiento del SNC. Disfunción acreditación está vinculada a muchos trastornos neurológicos graves. Sin embargo, sólo muy pocos objetivos se han identificado en la interfaz cerebro-vascular para un tratamiento específico y eficaz 18. Simplificado en modelos in vitro se han utilizado para entender los mecanismos que intervienen en la función y regulación de los sistemas fisiológicos complejos de lotiempo ng. El aislamiento descrito por este manuscrito y el estudio in vitro de murino BMECs, dada la gran variedad de ratón específico knockout cepas, podría proporcionar una comprensión adicional de la acreditación función y regulación en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas que se abren nuevas vías terapéuticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bFGF</td>
			<td style="width:133px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-18B</td>
			<td style="width:331px;">Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BSA</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9418</td>
			<td>Bovine serum albumine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Collagenase CLS2</td>
			<td style="width:133px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004176</td>
			<td>High relative level of protease activity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagenase-dispase</td>
			<td style="width:133px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:123px;">10269638001</td>
			<td style="width:331px;">Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagen IV</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0543</td>
			<td style="width:331px;">From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5030</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DNAse</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F6178</td>
			<td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Heparin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3393</td>
			<td>Anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PDS</td>
			<td style="width:133px;">First Link UK Ltd.</td>
			<td style="width:123px;">60-00-850</td>
			<td>Plasma-derived serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Percoll</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1644</td>
			<td>Warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pyrumycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td>Should only be used in first 2 d of culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Inmediatamente después del aislamiento, BMECs murinos y células contaminantes forman conglomerados que flotan en el medio de cultivo celular (Figura 1A, día 0). El tratamiento con pyrumycin conduce a una selección de BMECs murinos ya que expresan altos niveles de transportadores de eflujo, tales como P-glicoproteína conduce a una resistencia relativa a las toxinas. Células contaminantes son mucho más susceptibles a la citotoxicidad mediada pyrumycin 19. Durante el proceso de selección pyrumicin, células contaminantes entran en la muerte celular apoptótica o necrótica, mientras que MBMECs comienzan a unirse a las colágeno IV / fibronectina recubierto de placas de cultivo celular (Figura 1A, día 1 y día 2). Hasta el día 5, los MBMECs proliferan a una densidad de aprox. 80 a 90%. Se caracterizan por la apariencia típica forma de huso. En la confluencia, que forman una monocapa de células de contacto inhibido que no se superponen perfectamente embalados, alineada longitudinalmente y (Figura 1A, el día 5). Porselección pyrumicin, una alta pureza de hasta el 99% MBMEC se alcanza como se ha demostrado por el marcador de células endoteliales CD31 (PECAM1; Figura 1B). Los MBMECs forman monocapas fuertemente sellados interconectados por proteínas de unión estrecha. Después de 7 - 8 días de cultivo, las capas de células endoteliales se acumulan los valores estables de resistencia eléctrica (alcanzando valores típicos entre 20 - 30 Ω cm x 2). Y la capacitancia (Figura 1C) En este punto de tiempo ensayos funcionales tales como por células experimentos de migración 3, 20,21 y permeabilidad pruebas, por ejemplo, con azul de Evans o dextrano, se deben realizar. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. morfológica y propiedades funcionales de murino BMECs. (A) curso temporal Representante de BMECs cultivadas vistos por la luz micro transmisiónSCOPY más de 5 días. Barra de escala se aplica para todas las imágenes. (B) La tinción de inmunofluorescencia para el marcador de células endoteliales CD31 en el día 5. CD31 (verde) y DAPI (azul). (C) Las células se precultivaron durante 5 días y luego se transfieren a un sistema automatizado para la análisis de las propiedades biofísicas (resistencia y capacitancia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.1K vistas.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Video: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; In Vitro</em&gt; Barrera hematoencefálica modelo

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Investigación

Neurociencias

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migración, Chemo-Atracción, y Co-Cultura Ensayos para Células Endoteliales Derivadas de Células Madre Humanas y Neuronas GABAérgicas

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.