Este protocolo es significativo porque proporciona un enfoque general para la ingeniería de sistemas de dimerización de proteínas como biosensores para una variedad de moléculas pequeñas. Además, utiliza una biblioteca de proteínas muy diversa para seleccionar biosensores para diferentes ligandos de una manera eficiente y rentable sin la necesidad de equipos especializados. El biosensor de ingeniería se puede utilizar para controlar químicamente el comportamiento celular y para monitorear los cambios en tiempo real en los metabolitos celulares.
A través de esta demostración visual, los investigadores pueden observar una instrucción detallada de las técnicas con una clara expectativa de la producción experimental. Comience cada ronda de selección mediante el cultivo de una sola colonia celular competente en electroporación TG1 en seis mililitros de medio 2YT a 37 grados centígrados y 250 revoluciones por minuto a una absorbancia de 600 nanómetros de aproximadamente 0,5. Cuando se haya alcanzado la densidad óptica óptima, coloque las células sobre hielo.
Para preparar las cuentas de selección negativas, lave 300 microlitros de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina tres veces con un mililitro de 05%PBS más Tween buffer y dos veces con un mililitro de PBS por lavado en un bastidor de separación magnética. Resuspender las perlas con un mililitro de 1%caseína en PBS, y saturar las perlas con biotina a cinco veces la capacidad de unión reportada de las perlas. Después de una hora a temperatura ambiente con rotación, lave las cuentas cinco veces con PBS más Tween y tres veces con PBS como se demuestra.
Después del último lavado, agregue aproximadamente una vez 10 a las 13 partículas de fago en 1%caseína y 1%albúmina sérica bovina en PBS a las cuentas para una incubación de una hora a temperatura ambiente con rotación. Al final de la incubación, transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros. Para la selección positiva con las cuentas de estreptavidina ligand enlazadas biotiniladas, saturar la mitad del volumen de las cuentas utilizadas para la selección negativa en el ligando biotinilo de elección en cinco veces la capacidad de unión completa según se calcula de acuerdo con el manual.
Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente con rotación, lave las cuentas cinco veces con PBS más Tween y tres veces con PBS solo como se ha demostrado, y bloquee las cuentas con un mililitro de 1% de caseína y 1%albúmina sérica bovina durante una hora con rotación. Al final de la incubación, lave las cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina tres veces en PBS más Tween y una sola vez en PBS, como se ha demostrado, y utilice un fago sin consolidar para recuperar las cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Extraiga el sobrenadante que contiene fagos sin perforar sin alterar las perlas y deje la muestra a un lado para ser utilizada como entrada.
A continuación, lave las cuentas 10 veces con PBS más Tween y cinco veces con PBS como se ha demostrado, transfiriendo las cuentas a un tubo nuevo después de cada tres lavados para evitar la unión inespecífica de los fagos enlazados a las paredes del tubo. Para eluir competitivamente los fagos enlazados, agregue 450 microlitros de una concentración micromolar de ligando no biotinilado a las cuentas de selección positivas, y coloque las perlas en rotación durante 30 minutos. Al final de la incubación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo que se utilizará como salida.
Para la valoración de entrada, prepare 10 diluciones en serie en PBS hasta una por 10 a la nueve veces con el fago de entrada. Transfiera 10 microlitros de fago de entrada de uno por 10 a siete a 10 a las nueve diluciones a alícuotas de 70 microlitros de las células TG1 preparadas. Después de 45 minutos a 37 grados Celsius, placa las células TG1 infectadas en platos individuales de agar 2YT de 90 milímetros que contienen 100 microgramos por mililitro de ampicilina y 2%glucosa para una incubación nocturna a 37 grados Celsius.
A la mañana siguiente, utilice la fórmula para calcular la entrada de fagos. Para la infección de salida y la valoración, agregue los fagos eluidos a tres mililitros de células TG1 para una incubación de 45 minutos en un baño de agua Celsius de 37 grados. Luego prepare 10 diluciones en serie de las células infectadas en medio 2YT fresco hasta una vez 10 a la tercera concentración, y plato cada dilución en platos de agar 2YT de 90 milímetros para su incubación durante la noche a 37 grados Celsius.
A la mañana siguiente, calcule la salida del fago de acuerdo con la fórmula. Para aislar clones individuales de una subbibliancia enriquecida, transfiera colonias individuales de las placas celulares TG1 infectadas por fagos durante la noche a 250 microlitros de medio 2YT complementados con ampicilina por pozo en placas estériles de pozo profundo para su cultivo nocturno a 37 grados centígrados. Cuando las células alcancen una densidad de 600 nanómetros de aproximadamente 0,5, agregue cinco veces 10 a las nueve unidades formadoras de placas por mililitro de fago auxiliar CM13 a cada pozo, e incubar las células durante 45 minutos a 37 grados Celsius a 250 rotaciones por minuto.
Al final de la incubación, añadir 500 microlitros de 2YT medio complementado con ampicilina y 50 microgramos por mililitro de kanamicina a cada pocóter, y colocar la placa a 25 grados Celsius y 250 rotaciones por minuto durante la noche. A la mañana siguiente, sedimentar las células por centrifugación para permitir la recolección de las partículas de fagos. Para validar la unión de anclaje por ELISA, cubra las placas ELISA de 96 pozos con 100 microlitros de cinco microgramos por mililitro de estreptavidina en tampón de recubrimiento a cuatro grados centígrados durante la noche.
A la mañana siguiente, lave las placas tres veces en 300 microlitros de PBS más Tween antes de añadir 100 microlitros de diana biotinilada de un micromolar a los pozos objetivo y 100 microlitros de biotina de un micromolar o homólogo objetivo a los pozos de control adecuados. Después de una hora a temperatura ambiente, lave las placas cinco veces con PBS más Tween por lavado, y bloquee cualquier unión no específica con 300 microlitros de 1% de caseína por pozo durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las placas tres veces en PBS fresco más Tween por lavado, y agregue el sobrenadante de fago purificado.
Después de una hora a temperatura ambiente, lave las placas 10 veces con PBS fresco más Tween por lavado. Añadir 100 microlitros de rábano picante peroxidasa M13 anticuerpo de proteína de recubrimiento principal a cada pozo para una incubación de una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave las placas tres veces como se ha demostrado, y agregue 100 microlitros de sustrato de TMB a cada pozo para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente o hasta que se observe un cambio de color visible.
A continuación, detenga la reacción con 100 microlitros de ácido clorhídrico de un molar por pozo, y lea la placa a 450 nanómetros en un espectrofotómetro. Después de la validación del aglutinante de anclaje, el cribado aglutinante de dimerización también debe realizarse utilizando la misma biblioteca de proteínas dirigida al complejo de aglutinante-ligand de anclaje. Los resultados típicos de enriquecimiento después de cuatro a seis rondas de selección son una buena indicación de que hay una alta proporción de golpes potenciales en los sublibrarios, en cuyo caso pueden no ser necesarias nuevas rondas de selección.
ELISA de un solo clon es adecuado para analizar la afinidad de unión relativa y la selectividad de los aglutinantes de anclaje y dimerización y facilita la comparación de la selectividad de unión entre clones. Del mismo modo, la selección del aglutinante de dimerización permite la identificación de clones que forman un heterodémero con el aglutinante de anclaje inmovilizado sólo con o sin el ligando. Estos datos de unión dependientes de la concentración de ligandos sugieren que los nanocuerpos probados son adecuados para construir un sistema de dimerización inducido químicamente en comparación con la mala unión demostrada por las muestras de control.
Además, se puede utilizar la cromatografía analítica de exclusión de tamaño para confirmar la formación de heterodímeros entre los aglutinantes de anclaje y dimerización en presencia del ligando. Por ejemplo, en este experimento, se observó un pico de dimerización cuando se mezclaron los aglutinantes de anclaje y dimerización y el cannabidiol. Por el contrario, no se detectó ningún pico de dimerización en ausencia de cannabidiol o cuando cada aglutinante se cargó solo en la columna.
El sistema de dimerización proteica debe estar genéticamente codificado en células de levadura o mamíferos para permitir una mayor verificación de los biosensores seleccionados para el desarrollo de aplicaciones in vivo. Esperamos que este método proporcione a otros investigadores las herramientas efectivas y necesarias para detectar metabolitos importantes, moléculas de señalización o fármacos in vivo con una alta resolución espaciotemporal.
