Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es einen allgemeinen Ansatz für die Entwicklung von Protein-Dimerisierungssystemen als Biosensoren für eine Vielzahl von kleinen Molekülen bietet. Darüber hinaus nutzt es eine sehr vielfältige Proteinbibliothek, um Biosensoren für verschiedene Liganden effizient und kostengünstig auszuwählen, ohne dass spezielle Geräte benötigt werden. Der entwickelte Biosensor kann verwendet werden, um das Zellverhalten chemisch zu steuern und Veränderungen in Zellmetaboliten in Echtzeit zu überwachen.
Durch diese visuelle Demonstration können die Forscher eine detaillierte Anleitung der Techniken mit einer klaren Erwartung des experimentellen Ergebnisses beobachten. Beginnen Sie jede Auswahlrunde, indem Sie ein einzelnes TG1-Elektroporations-fähiges Zellvolk in sechs Millilitern 2YT-Medium bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute auf eine 600-Nanometer-Absorption von etwa 0,5 anbauen. Wenn die optimale optische Dichte erreicht ist, legen Sie die Zellen auf Eis.
Um die negativen Selektionsperlen vorzubereiten, waschen Sie 300 Mikroliter Streptavidin-beschichtete Magnetperlen dreimal mit einem Milliliter 05%PBS plus Tween-Puffer und zweimal mit einem Milliliter PBS pro Wäsche auf einem magnetischen Trennträger. Setzen Sie die Perlen mit einem Milliliter 1%Casein in PBS aus, und sätten Sie die Perlen mit Biotin bei der fünfmal so hoch bezeichneten Bindungskapazität der Perlen. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur mit Rotation die Perlen fünfmal mit PBS plus Tween und dreimal mit PBS waschen, wie gezeigt.
Nach der letzten Wäsche etwa ein mal 10 zu den 13 Phagenpartikeln in 1%Casein und 1%rinderserumalbumin in PBS zu den Perlen für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur mit Rotation hinzufügen. Am Ende der Inkubation den Überstand in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen. Zur positiven Selektion mit den biotinylierten, ligaandgebundenen Streptavidinperlen die Hälfte des Volumens der Perlen, die für die negative Selektion in der biotinylierten Liganden der Wahl verwendet werden, bei der fünffachen vollen Bindungskapazität, wie nach dem Handbuch berechnet, sättigen.
Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur mit Rotation die Perlen fünfmal mit PBS plus Tween und dreimal mit PBS allein wie gezeigt, und blockieren Sie die Perlen mit einem Milliliter 1%Casein und 1%rinderserumalbumin für eine Stunde mit Rotation. Waschen Sie am Ende der Inkubation die mit Streptavidin beschichteten Magnetperlen dreimal in PBS plus Tween und einmal nur in PBS, wie gezeigt, und verwenden Sie ungebundenen Phagen, um die mit Streptavidin beschichteten Magnetperlen wieder aufzuhängen. Extrahieren Sie den ungebundenen phagenhaltigen Überstand, ohne die Perlen zu stören, und legen Sie die Probe beiseite, um als Eingabe verwendet zu werden.
Dann waschen Sie die Perlen 10 Mal mit PBS plus Tween und fünfmal mit PBS, wie gezeigt, die Perlen auf ein neues Rohr nach jeder drei Wäsche übertragen, um eine unspezifische Bindung der gebundenen Phagen an die Rohrwände zu vermeiden. Um die gebundenen Phagen wettbewerbsfähig zu machen, fügen Sie 450 Mikroliter einer mikromolaren Konzentration von nicht-biotinyliertem Liganden zu den positiven Selektionsperlen hinzu und legen Sie die Perlen 30 Minuten lang auf Rotation. Übertragen Sie den Überstand am Ende der Inkubation in ein neues Rohr, das als Ausgang verwendet werden soll.
Für die Eingangstitration 10 serielle Verdünnungen in PBS bis zu einem Mal 10 bis zum Neunfachen mit dem Eingangsphagen vorbereiten. Übertragen Sie 10 Mikroliter Eingangsphagen von den einmal 10 auf die sieben bis zehn auf die neun Verdünnungen auf 70-Mikroliter-Aliquots der vorbereiteten TG1-Zellen. Nach 45 Minuten bei 37 Grad Celsius die infizierten TG1-Zellen auf einzelne 90-Millimeter-Agar-Gerichte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin und 2% Glukose für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius aufweisen.
Verwenden Sie am nächsten Morgen die Formel, um den Phageneingang zu berechnen. Für Eine Ausgangsinfektion und Titration die eluierten Phagen zu drei Millilitern TG1-Zellen für eine 45-minütige Inkubation in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad hinzufügen. Dann bereiten Sie 10 serielle Verdünnungen der infizierten Zellen in frischem 2YT-Medium bis zu einem mal 10 bis zur dritten Konzentration vor und verdünnen Sie jede Verdünnung auf 90-Millimeter 2YT Agar-Gerichte für ihre nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Berechnen Sie am nächsten Morgen die Phagenausgabe nach der Formel. Um einzelne Klone aus einer angereicherten Unterbibliothek zu isolieren, übertragen Sie einzelne Kolonien aus den über Nacht kultivierten, phageninfizierten TG1-Zellplatten in 250 Mikroliter 2YT-Medium, ergänzt mit Ampicillin pro Brunnen in sterilen Tiefbrunnenplatten für ihre Nachtkultur bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen eine Dichte von 600 Nanometern von etwa 0,5 erreichen, fügen Sie den neun Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter CM13-Helferphagen fünfmal 10 zu und bebrüten die Zellen 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius bei 250 Umdrehungen pro Minute.
Am Ende der Inkubation 500 Mikroliter 2YT-Medium mit Ampicillin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte über Nacht auf 25 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute legen. Am nächsten Morgen sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, um die Entnahme der Phagenpartikel zu ermöglichen. Um die Ankerbindung durch ELISA zu validieren, beschichten Sie 96-Well-ELISA-Platten mit 100 Mikrolitern von fünf Mikroliter pro Milliliter Streptavidin im Beschichtungspuffer bei vier Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Morgen die Platten dreimal in 300 Mikroliter PBS plus Tween waschen, bevor 100 Mikroliter einmikromolares Biotinylziel in die Zielbrunnen und 100 Mikroliter Einmikromollarbiotin oder Zielhomolog in die entsprechenden Kontrollbrunnen gegeben werden. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Platten fünfmal mit PBS plus Tween pro Waschgang waschen und jede unspezifische Bindung mit 300 Mikrolitern 1%Casein pro Brunnen für eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren. Am Ende der Inkubation die Teller dreimal in frischem PBS plus Tween pro Wäsche waschen und den gereinigten Phagenüberstand hinzufügen.
Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Teller 10 Mal mit frischem PBS plus Tween pro Waschgang waschen. Fügen Sie 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase M13 HauptbeschichtungProteinAntikörper zu jedem Brunnen für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Platten dreimal wie gezeigt, und fügen Sie 100 Mikroliter TMB-Substrat zu jedem Brunnen für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur oder bis eine sichtbare Farbänderung beobachtet wird.
Dann stoppen Sie die Reaktion mit 100 Mikrolitern ein-Molaren-Salzsäure pro Brunnen, und lesen Sie die Platte bei 450 Nanometern auf einem Spektralphotometer. Nach der Ankerbindervalidierung sollte das Dimerisierungsbinder-Screening auch mit derselben Proteinbibliothek durchgeführt werden, die auf den Ankerbinder-Ligand-Komplex abzielt. Typische Anreicherungsergebnisse nach vier bis sechs Auswahlrunden sind ein gutes Indiz dafür, dass es in den Unterbibliotheken ein hohes Verhältnis potenzieller Treffer gibt, in diesem Fall sind weitere Auswahlrunden möglicherweise nicht erforderlich.
Single-Clone-ELISA eignet sich zur Analyse der relativen Bindungsaffinität und Selektivität von Anker- und Dimerisierungsbindern und erleichtert den Vergleich der Bindungsselektivität zwischen Klonen. Ebenso ermöglicht die Dimerisierungsbinderauswahl die Identifizierung von Klonen, die einen Heterodimer mit dem immobilisierten Ankerbinder nur mit oder ohne Liganden bilden. Diese ligaanden konzentrationsabhängigen Bindungsdaten deuten darauf hin, dass die getesteten Nanokörper für den Aufbau eines chemisch induzierten Dimerisierungssystems im Vergleich zu der schlechten Bindung geeignet sind, die durch die Kontrollproben nachgewiesen wird.
Darüber hinaus kann die analytische Größenausschlusschromatographie verwendet werden, um die Heterodimerbildung zwischen Anker- und Dimerisationsbindern in Gegenwart des Liganden zu bestätigen. In diesem Experiment wurde beispielsweise ein Dimerisierungsgipfel beobachtet, wenn Anker- und Dimerisationsbindemittel und Cannabidiol gemischt wurden. Im Gegensatz dazu wurde kein Dimerisierungspeak in Abwesenheit von Cannabidiol oder wenn jeder Binder allein auf die Säule geladen wurde, erkannt.
Das Proteindimerisierungssystem sollte genetisch in Hefe- oder Säugetierzellen kodiert werden, um eine weitere Überprüfung der ausgewählten Biosensoren für die Entwicklung von In-vivo-Anwendungen zu ermöglichen. Wir erwarten, dass diese Methode anderen Forschern die effektiven und notwendigen Werkzeuge zum Nachweis wichtiger Metaboliten, Signalmoleküle oder Medikamente in vivo mit einer hohen raumzeitlichen Auflösung geben wird.
