פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מספק גישה כללית להנדסת מערכות עמעום חלבונים כמו biosensors עבור מגוון רחב של מולקולות קטנות. בנוסף, היא משתמשת בספריית חלבונים מגוונת מאוד כדי לבחור biosensors עבור ליגנדים שונים בצורה יעילה וחסכונית ללא צורך בציוד מיוחד. הביו-סנסור המהונדס יכול לשמש לשליטה כימית בהתנהגות התאים ולניטור שינויים בזמן אמת במטבוליטים של התאים.
באמצעות הדגמה חזותית זו, החוקרים יכולים לצפות בהוראה מפורטת של הטכניקות עם ציפייה ברורה לתפוקה הניסיונית. התחל כל סיבוב של בחירה על ידי גידול מושבת תאים אחת TG1 אלקטרופולציה כשירה בשישה מיליליטר של מדיום 2YT ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 מהפכות לדקה לספיגה 600 ננומטר של כ 0.5. כאשר הצפיפות האופטית האופטית האופטימלית הושגה, מקם את התאים על קרח.
כדי להכין את חטוזי הבחירה השליליים, שטפו 300 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטבידין שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 05%PBS בתוספת חיץ Tween ופי שניים עם מיליליטר אחד של PBS לכל שטיפה על מתלה הפרדה מגנטית. תוכלו להתרכך מחדש עם מיליליטר אחד של 1%casein ב-PBS, ולהרווי את חרוזים עם ביוטין פי חמישה מקיבולת הכריכה המדווחת של חרוזים. לאחר שעה בטמפרטורת החדר עם סיבוב, לשטוף את חרוזים חמש פעמים עם PBS בתוספת Tween ושלוש פעמים עם PBS כפי שהוכח.
לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו בערך פי 10 ל-13 חלקיקי הפאג' ב-1%קאזין ו-1%אלבומין סרום בקר ב-PBS ל-PBS כדי לקבל דגירה של שעה בטמפרטורת החדר עם סיבוב. בסוף הדגירה, מעבירים את העל-טבעי לצינור של 1.5 מיליליטר. לבחירה חיובית עם חמוזי סטרפטבידין הקשורים לליגנד, רווי מחצית מנפח חרוזים המשמשים לבחירה השלילית בליגה הביוטינילציה של הבחירה פי חמישה מקיבולת הכריכה המלאה כפי שחושבה על פי המדריך.
לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר עם סיבוב, לשטוף את חרוזים חמש פעמים עם PBS בתוספת Tween ושלוש פעמים עם PBS לבד כפי שהוכח, ולחסום את חרוזים עם מיליליטר אחד של 1% קסטין ו 1% אלבומין סרום בקר במשך שעה אחת עם סיבוב. בסוף הדגירה, לשטוף את חרוזים מגנטיים מצופה סטרפטבידין שלוש פעמים PBS בתוספת Tween ופעם אחת PBS לבד כפי שהוכח, ולהשתמש פאג ' מאוגד כדי resuspend את גם גם ציפוי streptavidin חרוזים מגנטיים. מוציאים את הפאג' הלא מאוגד המכיל על-טבעי מבלי להפריע לחבילות, ומניחים את הדגימה בצד כדי שתשמש כקלט.
לאחר מכן לשטוף את חרוזים 10 פעמים עם PBS בתוספת Tween וחמש פעמים עם PBS כפי שהודגם, העברת חרוזים צינור חדש לאחר כל שלוש שטיפות, כדי למנוע כריכה לא ספציפית של פאג'ים כבולים לקירות הצינור. כדי להשתיק באופן תחרותי את הפאג'ים המאוגדים, הוסיפו 450 מיקרוליטרים של ריכוז מיקרומולארי של ליגנד שאינו ביוטינילציה לחרוזי הבחירה החיוביים, והמקמו את חרוזים על סיבוב במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, להעביר את supernatant לתוך צינור חדש כדי לשמש פלט.
עבור טיטריאז' קלט, הכן 10 דילולים טוריים ב- PBS עד פי 10 עד פי תשעה עם פאג' הקלט. מעבירים 10 מיקרוליטרים של פאג' קלט מה-10 ל-7 עד 10 לתשעת הדילולים ל-70 מיקרוליטר של תאי ה-TG1 המוכנים. לאחר 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, צלחת תאי TG1 נגועים על בודדים 90 מילימטר 2YT אגר מנות המכילות 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין ו 2% גלוקוז עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר, השתמש בנוסחה כדי לחשב את קלט הפאג'. לזיהום תפוקה וגירוי, מוסיפים את הפאג'ים האלמותיים לשלושה מיליליטר של תאי TG1 עבור דגירה של 45 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכינו 10 דילולים סדרתיים של התאים הנגועים במדיום 2YT טרי עד פי 10 לריכוז השלישי, וצלחת כל דילול על 90 מילימטר 2YT אגר מנות עבור הדגירה שלהם לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר, לחשב את פלט הפאג ' על פי הנוסחה. כדי לבודד שיבוטים בודדים מתת-חיים מועשרים, העבר מושבות בודדות מצלחות התאים TG1 הנגועים בפאג' ל-250 מיקרוליטרים של מדיום 2YT בתוספת אמפיצילין ל הבאר בצלחות סטריליות עמוקות לתרבות הלילה שלהם ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מגיעים לצפיפות של 600 ננומטר של כ-0.5, מוסיפים פי 5 10 לתשע היחידות יוצרות הפלאק למיליליטר של פאג' עוזר CM13 לכל באר, ודחוסים את התאים במשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ב-250 סיבובים לדקה.
בסוף הדגירה, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיום 2YT בתוספת אמפיצילין ו -50 מיקרוגרם למיליליטר של קנאמיצין לכל באר, ומ מניחים את הצלחת על 25 מעלות צלזיוס ו 250 סיבובים לדקה לילה. למחרת בבוקר, מים את התאים על ידי צנטריפוגה כדי לאפשר איסוף של חלקיקי פאג'. כדי לאמת את כריכת העוגן על ידי ELISA, מעיל 96 גם צלחות ELISA עם 100 microliters של חמישה מיקרוגרם למיליליטר סטרפטבידין במאגר ציפוי בארבע מעלות צלזיוס לילה.
למחרת בבוקר, לשטוף את הצלחות שלוש פעמים ב 300 microliters של PBS בתוספת Tween לפני הוספת 100 microliters של מטרה biotinylated מיקרומולר אחד ל הבאר היעד ו 100 microliters של ביוטין מיקרומולארי אחד או הומולוג היעד ל בארות הבקרה המתאימות. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, שטפו את הצלחות חמש פעמים עם PBS בתוספת Tween לכביסה, וחסמו כל כריכה לא ספציפית עם 300 מיקרוליטרים של 1% קמין ל הבאר למשך שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחות שלוש פעמים PBS טרי בתוספת Tween לכל לשטוף, ולהוסיף את על טבעי פאג מטוהרים.
לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לשטוף את הצלחות 10 פעמים עם PBS טרי בתוספת Tween לכל לשטוף. הוסף 100 מיקרוליטרים של פרוקסידס חזרת M13 נוגדן חלבון מעיל גדול לכל באר עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף את הצלחות שלוש פעמים כפי שהודגם, ולהוסיף 100 microliters של מצע TMB לכל באר עבור דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר או עד שינוי צבע גלוי נצפתה.
ואז לעצור את התגובה עם 100 microliters של חומצה הידרוכלורית טוחה אחת לגם, ולקרוא את הצלחת ב 450 ננומטר על ספקטרופוטומטר. לאחר אימות קלסר עוגן, הקרנת אוגדן עמעום צריכה להתבצע גם באמצעות אותה ספריית חלבונים המכוונת למתחם קלסר-ליגנד עוגן. תוצאות העשרה אופייניות לאחר ארבעה עד שישה סבבי בחירה הם אינדיקציה טובה לכך שיש יחס גבוה של כניסות פוטנציאליות בתת-קטגוריות, במקרה זה ייתכן שלא יהיה צורך בסבבי בחירה נוספים.
ELISA עם שיבוט יחיד מתאים לניתוח הזיקה היחסית לכריכה ולסלקטיביות של קלסרים של עוגן ועמעום ומאפשר השוואה של סלקטיביות מחייבת בין שיבוטים. כמו כן, בחירת קלסר דימריזציה מאפשרת זיהוי של שיבוטים יוצרים הטרודימר עם קלסר העוגן משותק רק עם או בלי ligand. נתונים מחייבים תלויי ריכוז ליגנד אלה מצביעים על כך שננו-bodies שנבדקו מתאימים לבניית מערכת עמעום הנגרמת כימית בהשוואה לכריכה הלקויה שהוכחה על ידי דגימות הבקרה.
כמו כן, ניתן להשתמש כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל אנליטי כדי לאשר את היווצרות ההטרודימר בין קלסרים עוגן ודימריזציה בנוכחות הליגנד. לדוגמה, בניסוי זה, שיא עמעום נצפתה כאשר קלסרים עוגן ודימריזציה וקנבידיול היו מעורבים. לעומת זאת, לא זוהה שיא עמעום בהיעדר קנבידיול או כאשר כל קלסר נטען לעמודה בלבד.
מערכת עמעום החלבון צריכה להיות מקודדת גנטית בתאי שמרים או יונקים כדי לאפשר אימות נוסף של הביו-סנסורים שנבחרו לפיתוח יישומי vivo. אנו מצפים כי שיטה זו תיתן לחוקרים אחרים את הכלים היעילים וההכרחיים לגילוי מטבוליטים חשובים, מולקולות איתות, או תרופות ב vivo עם רזולוציה מרחבית גבוהה.
