La organización espacial de las células inmunitarias en el microambiente tumoral tiene valor clínico. Esta estrategia se puede utilizar fácilmente para visualizar, cuantificar y mapear las células inmunitarias dentro del tejido tumoral. La inmunoterapia ha revolucionado el tratamiento oncológico.
Sin embargo, no todos los pacientes responden bien. Esta estrategia puede servir para definir las firmas inmunes a los tejidos que pueden predecir una buena respuesta antitumo tumoral. Antes de realizar un experimento, pruebe las combinaciones de anticuerpos y las técnicas de desprendimiento en los tejidos de control y verifique que las aplicaciones sean precisas en su detección de marcadores de interés.
Como las descripciones escritas de los métodos de análisis de imágenes utilizan un lenguaje técnico sofisticado, la combinación de texto con vídeo facilita una mejor comprensión y replicación de la metodología. Para la recuperación de antígenos de secciones de tejido tumoral fijadas en formalina, incrustadas en parafina, sumerja la muestra de tejido desparasito en un frasco de Coplin de solución de recuperación de antígenos y coloque el frasco en una olla de presión eléctrica que contenga agua del grifo. El nivel del agua no debe exceder la mitad de la altura del frasco para que el agua no se mezcle con la solución de recuperación de antígenos.
Cierre la tapa y la válvula de presión de la olla y trate los portaobjetos a alta presión durante 10 minutos. Al final del tratamiento, desenchufe la olla, suelte la presión y abra la tapa. Después de que los portaobjetos se hayan enfriado en la olla durante 30 minutos, lave las muestras dos veces durante cinco minutos en PBS fresco por lavado en un nuevo frasco de Coplin, luego use una pluma hidrófoba para dibujar una barrera alrededor de cada sección de tejido.
A continuación, sumerja los portaobjetos en 0,1-glicina molar en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de enjuagar los portaobjetos dos veces en PBS como se ha demostrado. Después del segundo lavado, transfiera los portaobjetos a una cámara de humedad y cubra cada sección del tejido con una solución de bloqueo. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, enjuague las secciones dos veces durante cinco minutos en PBS-Tween fresco por lavado y luego agregue los anticuerpos primarios de interés, diluidos en solución de bloqueo, a cada diapositiva, protegidos de la luz.
Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos tres veces en PBS-Tween fresco durante cinco minutos por lavado y, a continuación, etiquete las secciones con los anticuerpos secundarios adecuados durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos tres veces en PBS-Tween fresco durante cinco minutos por lavado. Siga con un solo enjuague en agua doble destilada.
Retire el exceso de agua de cada corredera y monte los tejidos con un medio de montaje complementado con DAPI y un portaobjetos de cubierta. Después de apretar el exceso de medio de montaje, deje que los portaobjetos se sequen durante 20 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz, antes de adquirir imágenes para todos los canales utilizando un escáner de deslizamiento completo. Después de escanear, abra las imágenes en el software de análisis de imágenes y haga clic en la pestaña Tissuealign.
Para importar las imágenes que se van a alinear en la bandeja de diapositivas, seleccione la primera imagen que desea alinear desde la base de datos. Cuando se hayan cargado todas las imágenes, haga clic en Siguiente en los pasos del flujo de trabajo para vincular las imágenes y arrastrar y soltar todas las imágenes que se alinearán en la primera imagen. Cuando todas las imágenes se hayan vinculado según corresponda, utilice un mínimo de tres pines por imagen que indiquen las entidades de tejido homólogo en las imágenes enlazadas.
Utilice un pasador para trazar la primera imagen para comprobar la calidad de la alineación resultante. Si se ha obtenido una alineación satisfactoria, haga clic en Siguiente para ver las capas de imagen y guardar la imagen compuesta en la base de datos. Para realizar una detección de tejido mediante el protocolo definido por el usuario APP 1, abra la pestaña Análisis de imagen y abra la imagen compuesta en el módulo de análisis de imágenes.
Haga clic en el icono Abrir APP y seleccione la APP adecuada. Para confirmar que la aplicación funciona, vaya a una ubicación de tejido seleccionada y haga clic en Vista previa. Si los resultados son satisfactorios, haga clic para procesar la imagen utilizando la APLICACIÓN seleccionada.
Durante el procesamiento, la APP determinará si el píxel está asociado o no con el tejido para permitir la conversión de todos los píxeles asociados al tejido en una región de interés. La región de interés recién creada se puede transferir a cualquiera de las imágenes alineadas. Al final del análisis, haga clic en Archivo y Guardar para guardar la imagen modificada con la región de interés recién creada.
Para la segmentación del tejido en estroma y parénquima, abra la pestaña Análisis de imagen y seleccione los archivos de interés de la base de datos. Open APP 2, APP 2 utiliza la imagen teñida de PSR para la segmentación de tejidos. Previsualice APP 2 procesando la imagen en un campo de visión seleccionado.
Si los resultados son satisfactorios, haga clic en Ejecutar para procesar APP 2 en la imagen completa. La región de interés del tejido se segmentará en estroma y parénquima y se determinarán sus respectivas áreas. Las regiones recién creadas de interés para el estroma y el parénquima se pueden transferir a las imágenes alineadas y, a continuación, exportar y guardar la imagen modificada como se muestra.
Para identificar y cuantificar las poblaciones celulares de interés, importe la imagen segmentada de interés en el módulo de análisis de imágenes. Después de ajustar el color, abra APP 3. APP 3 detectará las poblaciones celulares de interés y las cuantificará dentro del parénquima y el estroma.
Si los resultados son satisfactorios, ejecute APP 3 en la imagen completa. Se etiquetarán todas las células individuales de interés, se almacenarán sus coordenadas tisulares y se determinarán las densidades de las células de interés en las regiones estroma y parénquimal. La imagen modificada se puede guardar como se muestra.
Para realizar el mapeo térmico de tejido de los objetos etiquetados de celda de interés, abra el protocolo definido por el usuario adecuado en la ventana de selección de APP y haga clic en Ejecutar para solicitar a la APLICACIÓN que utilice las coordenadas de los objetos etiquetados con anticuerpos para generar el mapa de calor. Las áreas de puntos calientes, resaltadas en rojo, contienen la mayor densidad de la población celular de interés, mientras que las áreas de color azul oscuro tienen la más baja. El mapa de calor de una población celular específica se puede superponer a las imágenes alineadas para proporcionar información adicional sobre cómo se organizan estas células dentro del microambiente tumoral.
A continuación, exporte y guarde el mapa de calor del tejido. Es fundamental verificar la especificidad del etiquetado, la precisión de las aplicaciones diseñadas y la eficiencia de desmontaje y reprobado de las diferentes manchas en la misma sección. Mediante la integración de imágenes en serie, etiquetado secuencial y alineación de tejidos, se pueden visualizar más marcadores simultáneamente y se puede extraer más información de muestras clínicas limitadas.
La tinción H&E de secciones de tejido tumoral resectadas permite evaluar la arquitectura tisular, la morfología celular y parámetros clínicamente relevantes, como el tipo de neoplasia maligna, el grado tumoral y la infiltración inmune general. La tinción CD34 permite la detección de células endoteliales. La tinción de citoqueratina 8/18 revela la presencia de células epiteliales, y la tinción de actina muscular lisa anti alfa permite la identificación de células estelares fibrogénicas, activadas y hepáticas.
El reprobado con anticuerpos contra CD68 y Desmin permite la detección de macrófagos y miofibroblastos respectivamente. Para caracterizar mejor el infiltrado inmune al tumor, se puede realizar manchas para marcadores de células T y mieloperoxidasa. La tinción Picro Sirius Red también se puede realizar para visualizar el colágeno fibrilar y facilitar la segmentación del estroma y el parénquima.
Los píxeles asociados al tejido dentro de las secciones teñidas se pueden identificar para permitir la segmentación de diferentes compartimentos dentro de una región específica de interés. Las poblaciones celulares de interés se pueden identificar dentro de cada región, lo que permite la generación de mapas de tejidos para los que las regiones de alta densidad para una población celular determinada se muestran como puntos calientes y regiones con una densidad relativamente baja aparecen como puntos fríos. Esta metodología para identificar, cuantificar y mapear células inmunitarias en muestras de tejido se puede adaptar y validar para una investigación específica preguntas y marcador de interés.
Esta estrategia se puede aplicar a micro arreglos de discos de tejido para un análisis de alto rendimiento. También se puede combinar con hibridación in situ para examinar simultáneamente la proteína in situ y la expresión génica. Hemos utilizado esta estrategia para identificar y mapear células productoras de IL-17A in situ en tejido hepático fibroso de pacientes.
Como se indica en el protocolo, varios reactivos son químicamente peligrosos y los procedimientos pertinentes deben realizarse en una campana química utilizando el equipo de protección personal adecuado y las precauciones.
