종양 마이크로 환경에서 면역 세포의 공간 조직은 임상 적 가치를 갖는다. 이 전략은 종양 조직 내의 면역 세포를 시각화, 정량화 및 매핑하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다. 면역 요법은 암 치료에 혁명을 일으켰습니다.
그러나 모든 환자가 잘 반응하는 것은 아닙니다. 이 전략은 좋은 항종양 반응을 예측할 수 있는 조직 면역 서명을 정의하는 역할을 할 수 있다. 실험을 수행하기 전에, 대조군 조직에 대한 항체 조합 및 스트리핑 기술을 테스트하고 APP가 관심있는 마커의 검출에 정확하다는 것을 확인합니다.
이미지 분석 방법에 대한 서면 설명은 정교한 기술 언어를 사용하므로 텍스트를 비디오와 결합하면 방법론을 더 잘 이해하고 복제할 수 있습니다. 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 종양 조직 섹션의 항원 회수를 위해, 항원 회수 용액의 코플린 항아리에 담그고 수돗물을 포함하는 전기 압력 밥솥에 항아리를 놓습니다. 수위는 물이 항원 검색 용액과 혼합되지 않도록 항아리 높이의 절반을 초과해서는 안됩니다.
뚜껑과 밥솥의 압력 밸브를 닫고 슬라이드를 고압으로 10분 동안 처리합니다. 치료가 끝나면 밥솥의 플러그를 뽑고 압력을 해제하고 뚜껑을 엽니다. 슬라이드가 30 분 동안 밥솥에서 냉각 된 후, 새로운 코플린 항아리에서 세척 당 신선한 PBS에서 샘플을 2 시간 동안 세척한 다음 소수성 펜을 사용하여 각 조직 섹션 주위에 장벽을 그립니다.
다음으로, PBS에서 0.1-어금니 글리신에 0.1-대구글리신을 실온에서 15분간 담그고 PBS에서 슬라이드를 두 번 헹구십시오. 두 번째 세척 후 슬라이드를 습도 챔버로 옮기고 차단 용액으로 각 조직 섹션을 덮습니다. 실온에서 30 분 후, 세척 당 신선한 PBS-Tween에서 5 분 동안 섹션을 두 번 헹구고 블록 용액에 희석 된 주요 항체를 빛으로부터 보호합니다.
인큐베이션이 끝나면 신선한 PBS-Tween에서 슬라이드를 세척당 5분 동안 세 번 헹구고 실온에서 1시간 동안 적절한 이차 항체로 섹션을 레이블을 지정합니다. 인큐베이션이 끝나면 신선한 PBS-Tween에서 슬라이드를 세 번 헹구고 세척당 5분 동안 헹구십시오. 이중 증류수에 하나의 헹구기를 따라가세요.
각 슬라이드에서 여분의 물을 제거하고 DAPI와 커버 슬라이드로 보충 장착 매체와 조직을 장착합니다. 초과 장착 매체를 압착한 후, 전체 슬라이드 스캐너를 사용하여 모든 채널에 대한 이미지를 수집하기 전에, 빛으로부터 보호, 실온에서 20 분 동안 건조 하게. 스캔 한 후 이미지 분석 소프트웨어에서 이미지를 열고 Tissuealign 탭을 클릭합니다.
슬라이드 트레이에 정렬할 이미지를 가져오려면 데이터베이스에서 정렬할 첫 번째 이미지를 선택합니다. 모든 이미지가 로드된 경우 워크플로 단계의 다음 단계를 클릭하여 이미지를 연결하고 모든 이미지를 첫 번째 이미지에 정렬하도록 드래그앤드롭합니다. 모든 이미지가 적절히 연결되면 연결된 이미지에서 동종 조직 특징을 나타내는 이미지 당 최소 3개의 핀을 사용합니다.
핀을 사용하여 첫 번째 이미지를 추적하여 결과 정렬의 품질을 확인합니다. 만족스러운 정렬을 얻은 경우 다음을 클릭하여 이미지 레이어를 보고 데이터베이스에 합성 이미지를 저장합니다. 사용자 정의 프로토콜 APP 1을 사용하여 조직 검출을 수행하려면 이미지 분석 탭을 열고 이미지 분석 모듈에서 합성 이미지를 엽니다.
열린 APP 아이콘을 클릭하고 적절한 APP를 선택합니다. APP가 작동하는지 확인하려면 선택한 조직 위치로 이동하여 미리 보기를 클릭합니다. 결과가 만족스럽다면 선택한 APP를 사용하여 이미지를 처리하려면 클릭합니다.
처리 하는 동안 APP는 픽셀이 관심의 영역으로 조직 관련 픽셀의 모든 변환을 허용 하기 위해 조직과 관련 된 여부를 결정 합니다. 그런 다음 새로 생성된 관심 영역을 정렬된 이미지로 이전할 수 있습니다. 분석이 끝나면 파일과 저장을 클릭하여 새로 만든 관심 영역을 사용하여 수정된 이미지를 저장합니다.
조직을 스트로마와 빈약한 종으로 세분화하려면 이미지 분석 탭을 열고 데이터베이스에서 관심 있는 파일을 선택합니다. 오픈 APP 2, APP 2는 조직 세분화를 위해 PSR 염색 된 이미지를 사용합니다. 선택한 시야에서 이미지를 처리하여 APP 2를 미리 봅니다.
결과가 만족스럽지 않으면 Run을 클릭하여 전체 이미지에서 APP 2를 처리합니다. 조직의 관심 영역은 스트로마와 당장 및 각 영역으로 세분화됩니다. 새로 생성된 스트로마 및 parenchyma에 대한 관심 영역은 정렬된 이미지로 전송한 다음 수정된 이미지를 설명한 대로 내보내고 저장할 수 있습니다.
관심 있는 셀 인구를 식별하고 정량화하려면 분할된 관심 이미지를 이미지 분석 모듈로 가져옵니다. 색상을 조정한 후 APP 3을 엽니다. APP 3은 관심있는 세포 인구를 감지하고 parenchyma 및 스트로마 내에서 정량화합니다.
결과가 만족스럽으면 전체 이미지에서 APP 3을 실행합니다. 관심있는 모든 개별 세포는 표시될 것입니다, 그들의 조직 좌표 저장, 그리고 결정된 기질 및 당면 한 지구에 관심있는 세포의 밀도. 그런 다음 수정된 이미지를 설명대로 저장할 수 있습니다.
관심 있는 표시 된 개체의 조직 열 매핑을 수행 하려면, APP 선택 창에서 적절 한 사용자 정의 프로토콜을 열고 실행을 클릭 하 여 응용 프로그램을 프롬프트 에 이방 레이블 개체의 좌표를 사용 하 여 열 맵을 생성 합니다. 빨간색으로 강조 표시된 핫스팟 영역은 관심 있는 세포 집단의 밀도가 가장 높은 반면 진한 파란색 영역은 가장 낮습니다. 특정 세포 집단의 열 맵은 이들 세포가 종양 미세 환경 내에서 조직되는 방법에 대한 추가 정보를 제공하기 위해 정렬된 이미지에 중첩될 수 있다.
그런 다음 조직의 히트 맵을 내보내고 저장합니다. 라벨링의 특이성, 설계된 APP의 정확도, 동일한 섹션의 다른 얼룩의 제거 및 재강탈 효율을 확인하는 것이 중요합니다. 연쇄 이미징, 순차적 라벨링 및 조직 정렬을 통합함으로써 더 많은 마커를 동시에 시각화할 수 있으며 제한된 임상 표본에서 더 많은 정보를 추출할 수 있습니다.
절제된 종양 조직 섹션의 H&E 염색은 조직 건축, 세포 형태 및 악성 종양 등급 및 전반적인 면역 침투의 모형과 같은 임상적으로 관련한 매개변수의 평가를 허용합니다. CD34 염색은 내피 세포의 검출을 허용합니다. 사이토케라틴 8/18 염색은 상피 세포의 존재를 드러내고, 항 알파 부드러운 근육 액틴 염색은 섬유겐성, 활성화된, 간 질산 세포의 식별을 가능하게 합니다.
CD68 및 Desmin에 대한 항체로 재포킹하면 각각 대식세포와 근섬유 세포의 검출이 가능합니다. 종양 면역 침투를 더 잘 특성화하기 위해 T 세포 마커 및 myeloperoxidase에 대한 염색을 수행 할 수 있습니다. 피크로 시리우스 레드 스테인링은 피브릴라 콜라겐을 시각화하고 스트로마와 파렌키마 세분화를 용이하게하기 위해 수행 될 수 있습니다.
스테인드 섹션 내의 조직 관련 픽셀은 관심의 특정 영역 내에서 다른 구획의 분할을 허용하도록 식별 될 수있다. 관심있는 세포 인구는 각 지역 내에서 식별 될 수있다, 주어진 세포 인구에 대한 고밀도의 영역이 핫 스팟으로 표시되는 조직지도의 생성을 허용하고 상대적으로 낮은 밀도를 가진 지역은 차가운 반점으로 나타납니다. 조직 샘플에서 면역 세포를 식별, 정량화 및 매핑하기 위한 이 방법론은 특정 연구 질문 및 관심 마커에 맞게 조정되고 검증될 수 있습니다.
이 전략은 높은 처리량 분석을 위해 조직 마이크로 어레이에 적용될 수 있습니다. 또한 시투 단백질 및 유전자 발현에서 동시에 검사하기 위해 시투 혼성화와 결합될 수 있다. 우리는 환자에서 섬유질 간 조직에 있는 조직에 있는 IL-17A 생성 세포를 확인하고 지도하기 위하여 이 전략을 이용했습니다.
프로토콜에 명시된 바와 같이, 몇몇 시약은 화학적으로 유해하며 관련 절차는 적절한 개인 보호 장비 및 예방 조치를 사용하여 화학 후드에서 수행되어야합니다.
