Пространственная организация иммунных клеток в микроокурении опухоли имеет клиническое значение. Эта стратегия может быть легко использована для визуализации, количественной оценки и картирования иммунных клеток в опухолевой ткани. Иммунотерапия произвела революцию в лечении рака.
Тем не менее, не все пациенты реагируют хорошо. Эта стратегия может служить для определения тканевых иммунных подписей, которые могут предсказать хороший противоопухо опухолевой ответ. Перед проведением эксперимента, проверить комбинации антител и зачистки методы на контроль тканей и проверить, что APPs являются точными в их обнаружении маркеров интереса.
Поскольку письменные описания методов анализа изображений используют сложный технический язык, сочетание текста с видео способствует лучшему пониманию и репликации методологии. Для поиска антигена формалин-фиксированных, парафин-встроенных секций опухолевых тканей, погрузить образец dewaxed ткани в Coplin банку антигена поиска раствора и поместить банку в электрическую скороварку, содержащую водопроводную воду. Уровень воды не должен превышать половины высоты банки, чтобы вода не смешивается с раствором поиска антигена.
Закройте крышку и клапан давления на плите и обработать слайды с высоким давлением в течение 10 минут. В конце лечения отключите плиту, отпустите давление и откройте крышку. После слайды остыли в плите в течение 30 минут, мыть образцы два раза в течение пяти минут в свежем PBS за стирку в новой банке Coplin, а затем использовать гидрофобные перо, чтобы нарисовать барьер вокруг каждой части ткани.
Затем погрузите слайды в 0,1-молярный глицин в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем полоскать слайды два раза в PBS, как попродемонстрировано. После второй стирки перенесите слайды в камеру влажности и накройте каждый участок ткани блокирующим раствором. После 30 минут при комнатной температуре, промыть разделы два раза в течение пяти минут в свежем PBS-Tween за стирку затем добавить основные антитела интереса, разбавленные в блокирующий раствор, к каждому слайду, защищены от света.
В конце инкубации, промыть слайды три раза в свежем PBS-Tween в течение пяти минут за стирку, а затем этикетки разделов с соответствующими вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации, промыть слайды три раза в свежем PBS-Tween в течение пяти минут за стирку. Следуйте с одного полоскания в двойной дистиллированной воды.
Удалите излишки воды с каждой горки и смонтировать ткани с монтажной средой, дополненной DAPI и крышкой слайда. Выдавлив излишки монтажной среды, дайте слайдам высохнуть в течение 20 минут при комнатной температуре, защищенной от света, прежде чем получить изображения для всех каналов с помощью сканера с цельного слайда. После сканирования откройте изображения в программном обеспечении для анализа изображений и нажмите на вкладку Tissuealign.
Для импорта изображений, которые будут выровнены в лоток слайда, выберите первое изображение, которое будет выровнено из базы данных. Когда все изображения были загружены, нажмите Далее в рабочей процесс шаги, чтобы связать изображения и перетащить и падение всех изображений, которые будут выровнены на первое изображение. Когда все изображения были связаны по мере необходимости, используйте как минимум три булавки на изображение, указывающие на гомологичные особенности тканей в связанных изображениях.
Используйте булавку, чтобы проследить первое изображение, чтобы проверить качество полученного выравнивания. Если было получено удовлетворительное выравнивание, нажмите Далее, чтобы просмотреть слои изображения и сохранить композитное изображение в базе данных. Для выполнения обнаружения тканей с помощью пользовательского протокола APP 1 откройте вкладку анализа изображений и откройте композитное изображение в модуле анализа изображений.
Нажмите на значок Open APP и вывехните соответствующее приложение. Чтобы подтвердить, что приложение работает, перейдите в выбранное местоположение ткани и нажмите Предварительный просмотр. Если результаты являются удовлетворительными, нажмите, чтобы обработать изображение с помощью выбранного APP.
Во время обработки APP определит, связан ли пиксель с тканью, чтобы позволить преобразование всех пикселей, связанных с тканью, в область интереса. Вновь созданный регион, представляющий интерес, может быть передан любому из выровненных изображений. В конце анализа нажмите Файл и Сохраните, чтобы сохранить измененное изображение с вновь созданной областью интереса.
Для сегментации ткани в строму и паренхиму откройте вкладку Анализ изображений и выберите файлы, представляющие интерес, из базы данных. Open APP 2, APP 2 использует изображение, окрашенное PSR, для сегментации тканей. Предварительный просмотр APP 2 путем обработки изображения в выбранном поле зрения.
Если результаты являются удовлетворительными, нажмите Run для обработки APP 2 на полном изображении. Область интереса ткани будет сегментирована на строму и паренхиму и определяться их соответствующие области. Вновь созданные области, представляющие интерес для стромы и паренхимы, могут быть переданы выровненным изображениям, а затем экспортировать и сохранить измененное изображение, как это было продемонстрировано.
Для выявления и количественной оценки групп ячейки, представляющих интерес, импортируют сегментированную изображение, представляющие интерес, в модуль анализа изображений. После настройки цвета откройте APP 3. APP 3 будет обнаруживать популяции клеток, представляющих интерес, и количественно их в паренхиме и строме.
Если результаты являются удовлетворительными, запустите APP 3 на полном изображении. Все отдельные клетки, представляющие интерес, будут помечены, их ткани координаты хранятся, и плотность клеток, представляющих интерес в стромы и паренхимальных областях определяется. Измененное изображение может быть сохранено, как попродемонстрировано.
Для выполнения тепловой обработки тканей помеченных объектов, помеченных ячейками, откройте соответствующий пользовательский протокол в окне выбора APP и нажмите Run, чтобы побудить APP использовать координаты объектов, помеченных антителами, для создания тепловой карты. Области горячих ток, выделенные красным цветом, содержат самую высокую плотность интересной популяции клеток, в то время как темно-синие области имеют самую низкую. Тепловая карта определенной популяции клеток может быть наложена на выровненные изображения, чтобы предоставить дополнительную информацию о том, как эти клетки организованы в микроокноронации опухоли.
Затем экспорт и сохранить карту тепла ткани. Очень важно проверить специфику маркировки, точность разработанных APPs, а также зачистки и reprobing эффективность различных пятен на том же разделе. Интегрируя серийную визуализацию, последовательное маркировку и выравнивание тканей, можно визуализировать больше маркеров одновременно, и больше информации может быть извлечено из ограниченных клинических образцов.
Окрашивание ресектированных секций опухолевых тканей позволяет оценку архитектуры тканей, морфологии клеток и клинически значимых параметров, таких как тип злокачественных новообразований, оценка опухоли и общее проникновение иммунной системы. Окрашивание CD34 позволяет обнаруживать эндотелиальные клетки. Цитокератин 8/18 окрашивания показывает наличие эпителиальных клеток, а анти-альфа гладкое мышечное актинное окрашивание позволяет идентифицировать фиброгенные, активированные, печеночные клетки стеллата.
Reprobing с антителами против CD68 и Desmin позволяют обнаружения макрофагов и миофибрабластов соответственно. Чтобы лучше охарактеризовать опухолевых иммунных проникнуть, окрашивание Т-клеточных маркеров и миелопероксидазы могут быть выполнены. Пикро Сириус Красное окрашивание также может быть выполнено для визуализации фибриллярского коллагена и для облегчения сегментации стромы и паренхимы.
Пиксели, связанные с тканью, в окрашенных секциях могут быть идентифицированы, чтобы позволить сегментации различных отсеков в пределах определенной области интереса. Затем можно определить группы клеток, представляющие интерес, в каждом регионе, что позволит разработать карты тканей, для которых регионы высокой плотности для данной популяции клеток отображаются в качестве горячих точек, а регионы с относительно низкой плотностью отображаются в качестве холодных пятен. Эта методология для выявления, количественной оценки и картирования иммунных клеток в образцах тканей может быть адаптирована и проверена для конкретных вопросов исследования и маркера интереса.
Эта стратегия может быть применена к микро массивам тканей для анализа высокой пропускной способности. Он также может быть объединен с на месте гибридизации одновременно изучить in situ белка и экспрессии генов. Мы использовали эту стратегию для выявления и карты IL-17A-производящих клеток на месте в фиброзной ткани печени у пациентов.
Как указано в протоколе, несколько реагентов являются химически опасными, и соответствующие процедуры должны выполняться в химическом капюшоне с использованием соответствующих средства индивидуальной защиты и мер предосторожности.
