LarvaSPA es el primer método que permite tomar imágenes en vivo continuas de larvas de drosophila intactas durante más de 10 horas con alta resolución temporal y espacial. Este método se utiliza para revelar procesos celulares dinámicos de las neuronas sensoriales periféricas de larvas y para estudiar muchos otros procesos celulares que ocurren cerca de la pared del cuerpo de la larva. Este método es fácil de usar y tiene menos limitación en el tamaño de la larva.
Se pueden montar de seis a nueve larvas en la cámara de imágenes al mismo tiempo, lo que hace posible el experimento. La cámara de imágenes de los cuboides PDMS se puede fabricar a un costo mínimo y son reutilizables. Este método es particularmente útil para estudiar los mecanismos de desarrollo de dendrita y degeneración dendrita utilizando neuronas de autorización dendrítica de larva de drosophila.
Ser capaz de imaginar la misma neurona durante horas puede revelar cómo los cambios globales a largo plazo de los patrones dendríticos surgen de comportamientos a corto plazo a nivel de rama individual. El uso de cuboides PDMS que coincidan con el tamaño de las larvas aumentará la tasa de éxito de las larvas inmovilizadoras. Encontrará más cintas útiles en nuestra sección de solución de problemas.
Después de construir un bloque de aluminio de una tienda de máquinas, selle la parte inferior del marco de metal usando un deslizamiento de cubierta larga con pegamento UV. Curar la pista UV utilizando una lámpara UV de mano durante 30 segundos. Fije las capas de cinta adhesiva a la superficie interior de una placa rectangular de Petri o de una placa de cultivo celular redonda.
Utilice una capa para larvas en la segunda estrella, dos capas para larvas del tercio temprano en la estrella, o tres capas para larvas de tercio tardío en estrella. Corte la cinta en viajes de anchura específica con una cuchilla de afeitar, 1,5 milímetros para la cinta de una capa y dos milímetros para la cinta de dos o tres capas. Deje al menos un espacio de cinco milímetros entre las dos tiras.
Retire las capas de cinta que cubren el espacio. Retire el polvo de la superficie interior de la placa con cinta adhesiva. Después de eso, el molde está listo para su uso.
Para preparar la mezcla PDMS, mezcle la base DE PDMS de siete gramos en 0,7 gramos de agente de curado a fondo en un recipiente pequeño. Coloque el recipiente en un desecador de vacío durante al menos 15 minutos para extraer el aire de la mezcla. Vierta lentamente alrededor de 5.5 gramos de mezcla PDMS en el molde para alcanzar un espesor de uno a dos milímetros.
Vuelva a colocar la mezcla PDMS en el desecador de vacío durante al menos 15 minutos para eliminar las burbujas de aire restantes de la mezcla. Rompe las últimas burbujas con una punta de pipeta. Curar el PDMS en una superficie plana en una incubadora de calor a 65 grados Celsius durante dos horas.
A continuación, utilice una cuchilla de afeitar para aflojar los PDMS curados a lo largo del borde del molde y separarlo del molde. Almacene el PDMS entre dos piezas de cinta adhesiva grande a temperatura ambiente. Para larvas tempranas y finales del tercer en estrella, corte el PDMS en cuboides de ocho por uno por uno colocando la ranura creada por la tira de cinta en el centro del lado largo del cuboide.
Para las larvas de segunda estrella, corta el cuboide a ocho por uno por uno por uno milímetro. Para preparar el resguardo de la cubierta superior para el montaje, elija seis cuboides PDMS con ranuras que coincidan con los tamaños de las larvas. Retire el polvo de la superficie del PDMS con cinta adhesiva.
Adjunte cuatro piezas de cinta adhesiva de doble cara del tamaño de 12 por cinco milímetros en un resbalón de cubierta largo de 22 por 50 milímetros para fijar los cuboides PDMS más tarde. Ajuste los espacios entre las dos piezas de cinta de doble cara a la misma que la anchura de la ranura de PDMS. Aplique una pequeña gota de pegamento UV en la ranura de cada cuboide PDMS y agregue seis pequeñas gotas de pegamento UV en el espacio entre las cintas de doble cara en el resbalón de la cubierta.
Para preparar las larvas para el montaje, utilizando un par de fórceps, limpie las larvas en agua para eliminar los alimentos de la superficie corporal. Coloque las larvas limpias en un pequeño pedazo de papel tisú humedecido en un pequeño plato de Petri sin tapa y coloque la pequeña placa de Petri en un plato grande de Petri que contenga un pedazo de papel de tejido seco. En una capucha química, utilice una pipeta de transferencia de plástico para aplicar 160 a 240 microlitros de isoflurano sobre el papel de tejido seco y cierre la tapa de la placa grande de Petri.
Espere de dos a tres minutos mientras monitorea las larvas. Una vez que sus ganchos de boca dejen de moverse, saque las larvas del plato grande de Petri. Coloque las larvas inmovilizadas en el pegamento UV entre las cintas de doble cara en el resbalón de la cubierta con la cutícula dorsal mirando hacia el resbalón de la cubierta.
Cubra cada larva con un bloque PDMS y ajuste el tronco de la larva en la ranura del PDMS. Deje la cabeza y la cola de la larva fuera de la ranura de PDMS. Evite bloquear los espiráculos de la larva por el pegamento.
Presione hacia abajo en los extremos del bloque PDMS en la cinta de doble cara sin aplicar fuerza en la ranura. Tire suavemente de la cola de la larva para aplanar la cutícula bajo el PDMS. Use gafas de seguridad y utilice una lámpara UV de mano para curar el pegamento UV durante cuatro minutos en el ajuste alto.
Voltear el resbalón de la cubierta al revés y utilizar la lámpara UV para curar el pegamento UV durante otros cuatro minutos. Coloque un pequeño pedazo de papel de lente con el tamaño de 15 por 30 milímetros en la parte inferior de la cámara de imágenes. Humedezca el papel con 20 a 30 microlitros de agua.
Coloque el resbalón de la cubierta en la cámara para que las larvas estén orientadas hacia el interior de la cámara. Utilice el pegamento UV para adherir ambos extremos del deslizamiento de la cubierta a la superficie metálica. El lado dorsal de las larvas está listo para la toma de imágenes bajo un microscopio confocal.
Después de la toma de imágenes, retire el aceite en el resguardo de la cubierta superior con papel de lente. Separe el deslizamiento de la cubierta superior del marco de metal cortando en el espacio entre el resbalón de la cubierta y el marco de metal con una cuchilla de afeitar. La cámara de imágenes está lista para su reutilización.
Separe los cuboides PDMS del resbalón de la cubierta superior con fórceps. Enrolle los cuboides PDMS sobre cinta adhesiva para eliminar los residuos de pegamento y el polvo. Los cuboides PDMS están listos para su reutilización.
En este protocolo, las larvas de drosophila se inmovilizaron durante más de 10 horas para obtener imágenes continuas. Esta cifra muestra seis larvas de última hora en la estrella montadas en la cámara. Los troncos de las larvas estaban fijos mientras sus cabezas y colas eran libres de moverse.
Aquí, demostramos la aplicación de LarvaSPA en el estudio de la dinámica de dendrita neuronal y la degeneración dendrita utilizando la clase cuatro neuronas DA como modelo. Para inmovilizar con éxito las larvas utilizando este método, es fundamental dejar de exponer las larvas a isoflurano una vez que los ganchos bucales dejan de moverse y curan el pegamento UV antes de que las larvas se despierten por completo. Para estudiar la degeneración y regeneración de la dendrita, se pueden realizar lesiones por láser cuando las larvas se inmovilizan en la cámara de imágenes.
LarvaSPA nos ha ayudado a entender cómo las dendritas de crecimiento dinámico no pueden inerpar las células epidérmicas como en los proteoglicanos de células hepáticas y cómo la fosfatidilserina se expone en dendritas degenerantes después de una lesión láser. Proteja los ojos con gafas de seguridad mientras usa la lámpara UV. Las larvas que utilizan isoflurano deben realizarse en una campana de humo.
