Este método puede responder a la pregunta clave sobre el papel del sistema inmunitario innato en la infección por Clostridium, como si y cómo los macrófagos reconocen o fagocitos de este patógeno. La principal ventaja de este método es que se puede aplicar a muchas bacterias anaeróbicas diferentes, que el tiempo de infección puede ser manipulado, y que la administración oral representa la infección humana normal mucho más cerca. Después del cultivo, transfiera un mililitro del cultivo a una cubeta espectrofotómetro, y mida el OD600.
Transfiera la cantidad requerida a un tubo fresco de 1,5 mililitros para alcanzar un OD final de uno a 1,2 en un mililitro de volumen final. Lave una vez con un mililitro de 1X PBS y centrifugar a 5.000 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Resuspend en un mililitro de 1X PBS.
Añadir tres microlitros de solución de trabajo del tinte fluorescente preparado en la suspensión bacteriana de un mililitro. Incubar la muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de eso, lavar el Clostridioides difficile manchado una vez con 1X PBS para eliminar el tinte residual, y resuspend en un mililitro de 1X PBS para lograr un OD600 de 1.0.
En primer lugar, coloque una gota de 0,8% de agarosa de baja fusión sobre las larvas de pez cebra en un plato de Petri para cubrir. Ajuste suavemente las larvas a una posición lateral. Coloque el plato Petri sobre hielo durante 30 a 60 segundos para permitir que la agarosa de bajo derretimiento se solidifique.
Añadir 30%Danieau medio que contiene 0.02%a 0.04%tricaína para cubrir la agarosa. Para preparar la solución inyectable, añada un microlitro de 0,5% rojo fenol en solución PBS en nueve microlitros del inóculo Clostridioides difficile teñido con tinte. Cargue una aguja de microinyección calibrada con la solución de inyección utilizando un microcargador.
Monte la aguja cargada en un micromaniprógrafo y colóquela bajo un microscopio estéreo. Ajuste la presión de inyección entre 600 y 900 hectopascales. Ajuste el tiempo de inyección en 0,1 a 0,3 segundos para obtener nanolitros de 0,5 a 1,0.
Ajuste la aguja en el micromaniprógrafo en un ángulo de aproximadamente 45 grados, apuntando hacia las larvas incrustadas. Coloque la punta de la aguja por encima del tracto gastrointestinal, cerca del poro urogenital. Perforar a través de la agarosa, luego el músculo con la punta de la aguja.
A continuación, insértelo en el lumen intestinal e inyecte de 0,5 a 1,0 nanolitros de Clostridioides difficile. Utilice un microscopio de fluorescencia para monitorear las larvas inyectadas, y utilice una punta flexible de Microfúnte para recoger las larvas inyectadas correctamente para obtener imágenes confocales. En una placa de agarosa del 1,5% con ranuras, coloque una gota de 0,8% de agarosa de baja fusión sobre las larvas de pez cebra para cubrir.
Ajuste suavemente las larvas con las cabezas orientadas hacia la erguida en ángulos de 45 grados en la ranura y las colas contra la pared de la ranura. Operar suavemente la aguja a través de la agarosa, luego en la boca de las larvas de pez cebra, a través del esófago. Una vez que la punta de la aguja está dentro de la bombilla intestinal anterior, presione el pedal de inyección para liberar 0.5 a una nanolitros de cultivo de bacterias.
Llena el lumen del intestino. No deje que se desborde del esófago o cloaca. Retire suavemente la aguja de la boca del pez cebra.
Después de la gavage, rescatar las larvas de pez cebra infectadas de la agarosa con una punta flexible de Microloader cortando primero la agarosa, luego levantando las larvas. Transfiera estas larvas al medio estéril de 30%Danieau y enjuague dos veces. Después de anestesiar las larvas de pez cebra, agregue de 200 a 300 microlitros de 1% de agarosa de bajo derretimiento para cubrir las larvas anestesiadas.
Coloque la región infectada de las larvas contra un tobogán de vidrio lo más cerca posible. Deje que la agarosa se solidifique sobre hielo durante 30 a 60 segundos. Sumerja la agarosa en el medio de Danieau al 30%que contiene 0,02% a 0,04%tricaína.
Proceda a la imagen de las larvas con un microscopio de escaneo láser confocal. Después de eutanasiar las larvas de pez cebra infectadas, inserte una aguja en el tronco dorsal de las larvas de pez cebra cerca de la cabeza para inmovilizar el pez cebra. Retire la cabeza detrás de las branquias con una lanceta.
Inserte una segunda aguja en el centro del tronco dorsal. Inserte una tercera aguja en el abdomen del pez cebra y extraiga el intestino de la cavidad corporal. Utilice una aguja de microinyección para transferir de 10 a 15 intestinos a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de 1X PBS estéril.
Homogeneizar los intestinos con un peste para interrumpir el tejido y preparar homogeneizaciones. Asegúrese de que el pestillo llegue al fondo del tubo para interrumpir todos los intestinos por completo. En los homogeneizas, añadir Clostridioides difficile medio de cría que contenga ciclonestrina D y cefoxitina, con o sin taurocholato, e incubar en una cámara anaeróbica.
En este estudio, tanto los neutrófilos como los macrófagos llegan a los sitios de infección. El ejemplo de un fagocito de macrófago activado que fagoticiona dos bacterias muestra la limpieza por fagocitosis y la digestión de la etiqueta Clostridioides difficile. El microgavage para entregar Clostridioides difficile con etiqueta de fluorescencia en el lumen intestinal de las líneas de reportero de macrófagos y neutrófilos a los cinco días después de la fertilización imita el camino natural de la infección por Clostridioides difficile.
Sin embargo, los neutrófilos y macrófagos no mostraron una migración obvia al tracto gastrointestinal hasta 12 horas después del microgage. Mientras tanto, la fluorescencia de la etiqueta Clostridioides difficile desapareció después de unas cinco horas después de la microgavage. Las muestras intestinales 24 horas después de la infección fueron diseccionadas y mostraron crecimiento bacteriano.
No creció ninguna bacteria en el grupo de control. En puntos posteriores, las muestras incubadas sólo crecían en el medio que contenía TCA, lo que sugiere que el total de Clostridioides difficile en el intestino había formado esporas. 16S rDNA PCR identificó la bacteria cultivada como Clostridioides difficile, que produce ampecados específicos de PCR de tamaño predecible alrededor de 800 pares de bases.
Los cultivos de bacterias cultivados en una placa CHROMID aparecieron como colonias negras típicas, lo que indicó además que las bacterias de los intestinos del pez cebra eran Clostridioides difficile. Trabajar con bacterias anaeróbicas requiere que los pasos aeróbicos se mantengan cortos porque eso influye en la biología de las bacterias, por supuesto. La célula inmune innata en el pez cebra puede ser manipulada.
Por ejemplo, pueden descifrar el mecanismo de las respuestas innatas de las células inmunitarias a la infección. Nuestro método indicó que el pez cebra puede ser una herramienta para estudiar el patógeno anaeróbico del intestino humano. Trabajar con patógenos multirresistentes requiere que se tomen las medidas de seguridad adecuadas.
