Name: induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos
Uploaded: 2017-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Premio de Apoyo Wellcome Trust SIA 100329 / Z / 12 / Z a WAH y la beca de DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK

Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Cambridge. 1. Mantenimiento de animales <ol><li> Embriones de rana NOTA: Los embriones pueden ser criados y mantenidos de acuerdo con las instalaciones del animal y del laboratorio. Aquí se describe un ejemplo del mantenimiento de los animales. <ol><li> Preparar solución de solución de Barth (MBS) modificada 0,1x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 μM, NaHCO3 24 μM, HEPES 100 μM, MgSO4 8,2 μM, Ca (NO3) 2 3,3 μM y CaCl2 4,1 μM, pH 7,6 . </li><li> Obtener embriones de Xenopus laevis mediante fertilización in vitro. <ol><li> Inducir la ovulación en ranas adultas africanas ( Xenopus laevis) por inyección con gonadotropina sérica de yegua preñada una semana (60 UI) y 12 h (500 UI) antes de la puesta. </li><li> Recoger los ovocitos y fertilizarlos in vitro con testículo masculino homogeneizado. </li><li> RaiSe embriones en 0.1x MBS a 16-18 ° C. Etapa de los embriones de acuerdo con la tabla Normal de Xenopus laevis [ 14] . Tenga cuidado en la selección de embriones enteros y vivos para el experimento. </li></ol></li></ol></li><li> Embriones de pez cebra NOTA: Los embriones pueden ser criados y mantenidos de acuerdo con las instalaciones del animal y del laboratorio. Aquí se describe un ejemplo del mantenimiento de los animales. <ol><li> Preparar medio de embrión: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl _ { 2 } 0,33 mM, MgSO _ { 4 } 0,33 mM y azul de metileno al 0,00001%. </li><li> Mantener y cultivar la cepa WT AB Danio rerio a 26.5 ° C. </li><li> Recoger los embriones en la mañana de la fertilización, levantar hasta 4 d post fertilización (dpf) a 28 ° C en medio embrionario preparado como se describe anteriormente, seleccionar y poner en escena como se describe anteriormente [ 15] . </li></ol></li></ol> 2. Inducción de la hipoxia in vivo <li> Construcción de la cámara de incubación de gas <ol><li> Utilice un tanque acuático de cría ( Figura 1A ) que se utiliza normalmente en la instalación de peces para la construcción de cámara hipóxica. Este tanque debe encajar en una placa de 24 pocillos. </li><li> Preparar una placa de 24 pocillos de fondo de malla como se muestra en la Figura 1 . Quitar la parte inferior de plástico de la placa de 24 pocillos ( figura 1B ), por ejemplo , utilizando una fresadora para este fin. </li><li> Llenar el espacio entre el plástico de los pozos y las paredes de la placa con resina epoxi. Conecte un filtro de nylon ( Figura 1C ) con un diámetro de malla de 0,1-0,2 mm al plástico recubierto de resina y deje que la placa esté completamente seca. </li><li> Una vez seco, taladre tres o cuatro túneles ( Figura 1D ) de 10 mm de longitud y 5 mm de diámetro en las paredes de la placa recubierta de resina y malla. Sujete varillas de plástico o de Teflón( Figura 1E ) de diámetro apropiado y 30 mm de longitud a los túneles y colocar la placa en el tanque de elección. </li><li> Coloque la placa de 24 pocillos de fondo de malla en el tanque acuático de elección. Utilizando un tubo de silicona ( Figura 1F ), conecte un tanque de gas ( Figura 1G ) con la mezcla de O 2 / N 2 deseada u otra mezcla de gases de elección a una válvula distribuidora ( Figura 1H ) usando un regulador de gas apropiado (I) (BOC 200 bar). En este caso, utilice tanques de gas que contengan una mezcla de 5% de oxígeno y 95% de N 2 en los experimentos de hipoxia presentados aquí. </li><li> Ajuste el caudal de oxígeno en el medio de la cámara a 0,0017-0,0019 metros cúbicos por segundo. Bajo este caudal de gas, no debe observarse perturbación del medio en los pocillos de la placa. <ol><li> Utilice el regulador de gas de dos etapas de alta pureza para este propósito. Ajuste el regulador para reducir la presión interna del(1000 - 2500 PSI) a una presión de suministro de 10 PSI durante todo el experimento. Por lo tanto, de acuerdo con las especificaciones de este regulador de gas, se logró un caudal de 0,00189 metros cúbicos por segundo durante todo el experimento. </li></ol></li><li> Conecte la tubería de silicona y la válvula distribuidora a un difusor de disco de cerámica ( figura 1J ) dentro del tanque acuático. Cierre el tanque acuático y cierre cuidadosamente la tapa, cubriéndola con grasa de silicona ( Figura 1K ) (compare con la Figura 1 ). Si se requiere una temperatura no ambiente específica, coloque la cámara hipóxica en una incubadora de laboratorio de la temperatura requerida. </li><li> Dependiendo del tipo de embriones utilizados en el experimento, llene el tanque de cámara hipóxica con el medio embrionario apropiado y comience a difundir la mezcla de gases a través del difusor de disco de cerámica. Equilibrar durante 10-15 min. </li><li> Después del equilibrio con thE la mezcla de oxígeno deseada, mida la concentración de oxígeno en el agua usando un oxímetro o una sonda de oxígeno. Aquí, utilice un oxímetro con el sensor de fibra óptica disuelto de oxígeno y temperatura para este propósito. </li></ol></li><li> Inducción de hipoxia en embriones <ol><li> Selección cuidadosa de los embriones para el experimento, el uso de embriones enteros y vivos para la incubación de hipoxia. Aquí, nos embriones de rana de etapa 38 o embriones de pez cebra 4 dpf en los experimentos presentados aquí. </li><li> Colocar los platos de embrión en la incubadora ( Figura 1K ) que contiene la cámara de incubación de gas y dejarlos equilibrar a la temperatura de la incubadora. </li><li> Transferir cuidadosamente los embriones en los pocillos de la placa de 24 pocillos en malla ( Figura 1B ) de la cámara de incubación de gas, usando una pipeta de plástico. Utilice siempre una pipeta de plástico para la transferencia de embriones a través del protocolo. NOTA: Cada pozo de esta placa puede contener hastaA 5 embriones de rana de estadio 38 o hasta 7 embriones de pez cebra de 4 dpf. Etiquetar cuidadosamente los pozos si se utilizan diferentes genotipos. </li><li> Mantener la cámara de incubación de gas bajo una infusión constante con la mezcla gaseosa de elección durante 5 h o durante un tiempo más largo que se adapte al experimento. Utilizar aquí una mezcla de 5% de O $ ₂ $ y 95% de N $ ₂ $. </li><li> Con cuidado, transferir los embriones de la cámara de incubación de gas de nuevo al medio normoxic correspondiente al tipo de embrión e inmediatamente proceder con los pasos 3 o 4. </li><li> Si se requiere un tratamiento normoxico adicional, transfiera cuidadosamente los embriones al medio normoxico correspondiente al tipo embrionario. </li></ol></li></ol> 3. Control de la inducción exitosa de la hipoxia mediante el seguimiento de los niveles de HIF-1α <ol><li> Preparativos <ol><li> Preparar 0,4 mg / mL MS222 solución en 0,1x MBS. </li><li> Preparar el tampón de homogeneización: Comprar Radioimmunoprecipitation Tampón de ensayo (RIPA bUffer) para homogeneización de tejido y suplementar la cantidad de tampón necesaria para su experimento con inhibidor de proteasa hasta una concentración final 1: 100 v / v. </li><li> Preparar soluciones para Western blot. <ol><li> Preparar 4 x tampón de carga de gel Laemmli: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glicerol, SDS al 8% v / v, beta-mercaptoetanol al 4% v / v, azul Bromofenol al 0,5% p / v volumen total ddH2 O. </li><li> Preparar 5x tampón de funcionamiento: 15 g de base de Trizma, 72 g de glicina, 5 g de SDS, 1 l de volumen total de ddH 2 O. </li><li> Preparar tampón de transferencia: 2,66 g de base de Trizma, 14,4 g de glicina, 200 ml de metanol al 100%, 1 l de volumen total de ddH 2 O. </li><li> Preparar 10 x TBST: 5 ml Tris 1 M pH 8,0, 30 ml 5 M NaCl, 2,5 ml Tween 20, 1 L volumen total H 2 O. </li><li> Preparar la solución de bloqueo: 4% p / v de leche desnatada en polvo en 1x TBST. </li></ol></li></ol></li><li> Colección de tejido <ol><li> Anestesiar los embriones bañándose en una solución de 0,4 mg / ml de MS22216 , 17 y transferirlos a un tubo de reacción de plástico lleno de tampón de homogeneización usando una pipeta de plástico. Utilizar 20 μ l de buffer por embrión. Obsérvese que al menos 5 embriones de rana de etapa 38 ó 7 embriones de pez cebra de 4 dpf son necesarios para determinar un cambio significativo en los niveles de proteína HIF1α. </li><li> Homogeneizar el tejido utilizando un homogeneizador tisular apropiado o un sonicador. Eliminar los residuos por centrifugación (15 min, 13.000 xg, 4 ° C). <ol><li> Alternativamente, disecar las retinas de los embriones de rana anestesiados 17 y homogeneizar como se ha indicado anteriormente. Utilizar 20 μl de tampón de homogeneización por 10 retinas. </li></ol></li><li> Tomar el sobrenadante usando una pipeta, desnaturalizar a 85 ° C durante 5 min y suplementar con tampón de carga de gel de Laemmli hasta una concentración final de 1x v / v ( por ejemplo , añadir 5 μl de tampón Laemmli 4x a 15 μl de homogeneizado). Utilice este sobrenadante para los WesTern blot o congelar las muestras a -20 ° C. </li></ol></li><li> Mancha occidental <ol><li> Cargar las muestras preparadas como se describe en el Paso 3.2 sobre un gel prefabricado al 12% en un sistema de electroforesis usando tampón de funcionamiento 1x v / v. Use una escalera de proteína para determinar el tamaño de la proteína. Transferir las proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa (membrana de 0,45 μm) en tampón de transferencia durante 1 h envasado en hielo a 4 ° C, según el protocolo del fabricante. </li><li> Bloquear sitios de unión inespecíficos que incuban la membrana en tampón de bloqueo durante 60 minutos. Siga con 3 x 10 min de lavado en 1x TBST. </li><li> Incubar la membrana en soluciones de anticuerpo anti-HIF-1α de conejo y anti-α-tubulina de ratón diluidas 1: 100 v / v y 1: 5000 v / v, respectivamente, en solución de bloqueo, durante 2,5 h a TA. Siga con 3 x 10 min de lavado en 1x TBST. </li><li> Para la detección, incubar en cabra anti-conejo y cabra anti-ratón HRP conjugado anticuerpos diluido 1: 1000 v / v en solución de bloqueo durante 1 h.Seguir con 3 x 10 min de lavado en 1x TBST y visualizar la tinción HRP usando un kit comercial y una máquina de revelado de elección. </li><li> Cuantificar la cantidad de proteína HIF1α utilizando la cuantificación digital. </li></ol></li></ol> 4. Control de la proliferación celular en la hipoxia <ol><li> Preparativos <ol><li> Preparar solución de EDU 5 mM en el medio de embrión de elección. La solución se puede utilizar inmediatamente o alicuotar y almacenarse a -20 ° C durante un máximo de 6 meses. </li><li> Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) o comprar PBS a partir de recursos comerciales. Autoclave durante 10 minutos a 115 ° C. </li><li> Preparar soluciones para la detección de la incorporación de EdU. <ol><li> Preparar la solución de fijación: 4% v / v de solución madre de formaldehído al 16% en PBS. </li><li> Preparar solución de sacarosa: sacarosa al 30% p / v en PBS. </li><li> Preparar PBST: 0,1% v / v de Triton X-100 en PBS. </li><li> Preparar Solución de bloqueo: 10% v / v Suero de cabra inactivado por calor (HIGS) en PBST. </li><li> Preparar la solución DAPI: 4 &#39;, 6 - diamidino - 2 - fenilindol 1: 1000 v / v (DAPI) en PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Incubación de embriones en hipoxia para la incorporación de EDU <ol><li> Llenar la cámara de incubación de gas con 400-500 mL de solución EDU 5 mM suplementada con 1% v / v de DMSO. Pre-equilibrar la solución con la misma mezcla de gases utilizada en el experimento durante 15 min antes del experimento. Obsérvese que el volumen de la solución de incubación puede minimizarse fijando barras más cortas ( Figura 1E ) a la placa de fondo de malla. </li><li> Conectar la tubería de gas al cilindro de gas que contiene una mezcla gaseosa de 5% de O 2 y 95% de N 2 . Incubar la solución durante 15 min. </li><li> Transferir los embriones a la cámara hipóxica, distribuirlos uniformemente entre los pozos e incubar durante 2 h. Cada pozo puede caber hasta 5 embriones de rana de estadio 38 o hasta 7 embriones de pez cebra 4 dpf. </li><li> Analizar el embriónS para la incorporación de EdU. </li></ol></li><li> Tiempo de incubación de embriones en hipoxia e incorporación de EDU <ol><li> Llene la cámara de incubación de gas con 500 ml de medio de embrión de elección. Conectar el tubo de gas al cilindro de gas que contiene una mezcla de gas de 5% de O 2 y 95% de N 2 y equilibrar el medio con la mezcla de gases durante 15 min. </li><li> Transferir los embriones a la cámara hipóxica, distribuirlos uniformemente entre los pocillos e incubar durante un período de tiempo deseado hasta 48 h. Durante las últimas 1 h, sustituir el medio embrionario con 5 mM EDU solución suplementada con 1% v / v DMSO. </li><li> Transferir los embriones de nuevo a la placa normoxic y analizar para la incorporación EdU. </li></ol></li><li> Detección y análisis de la incorporación de EDU <ol><li> Anestesiar los embriones bañándolos en una solución de 0,4 mg / ml de MS222. </li><li> Transferir los embriones a un vial de vidrio adecuado y fijar mediante la incubación en solución de fijación de 2 haT RT o O / N a 4 ° C. Seguir con 3 x 10 min de lavado en PBS. Con cuidado, transfiera los embriones a la solución de sacarosa para la crioprotección del tejido. Incubar durante 4 h o hasta que los embriones se hundan en el fondo del vial de vidrio. </li><li> Incruste los embriones en el medio de incrustación (compuesto óptimo de temperatura de corte). La criosección bloquea inmediatamente con embriones o almacena hasta 14 d a -80 ° C. </li><li> Cryosection los bloques que contienen embriones usando un criostato. Recoja secciones de espesor de 12 μm (embriones de pez cebra) o 16 μm (embriones de rana) en portaobjetos de microscopio y deje secar. Procese cryosections inmediatamente o guarde a -20 ° C por hasta 3 meses. </li><li> Detectar la incorporación de EdU mediante tinción inmunofluorescente usando un kit de química comercial. Preparar la cantidad de Mezcla de Reacción EdU necesaria para el número de criosecciones en el experimento, según lo descrito por el fabricante. <ol><li> Para 500 μL de Mezcla de Reacción EdU, use 430 μl de tampón de reacción EdU 1X, 20 mu l de CuSO _ { 4} , 1,2 mu l de azida Alexa Fluor, 50 mu l de aditivo de tampón 1X EdU. </li></ol></li><li> Lavar las criosecciones una vez con PBS para eliminar el medio de incrustación y 3 x 5 min con PBST para permeabilizar el tejido. Incubar las criosecciones en solución de bloqueo durante 30 min. </li><li> Incubar las criosecciones con la Mezcla de Reacción de EdU durante 1 h y seguidas de 3 x 10 min de lavados en PBST. Se cubren las criosecciones con solución DAPI durante 15 min, seguidas de 3 x 10 min lavados en PBST. Montar las diapositivas con criogénicas teñidas en el medio de montaje, cubrir con cubreobjetos y dejar secar antes de analizar bajo un microscopio fluorescente o almacenar a 4 ° C hasta 1 año. </li><li> Analizar las criosecciones con tinción anti-EdU bajo un microscopio confocal invertido y determinar el número de células EdU-positivas utilizando cuantificación digital. </li></ol></li></ol>

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	<li>Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-altitude+physiology+and+pathophysiology:+implications+and+relevance+for+intensive+care+medicine.">High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine.</a> Crit Care. 11 (1), 203 (2007).</li><li>Grant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+level+and+acute+responses+to+hypoxia:+do+they+predict+physiological+responses+and+acute+mountain+sickness+at+altitude?.">Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?.</a> Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).</li><li>Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-binding+protein-1+(IGFBP-1)+mediates+hypoxia-induced+embryonic+growth+and+developmental+retardation.">Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation.</a> PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).</li><li>Ong, K. K., Dunger, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+growth+failure:+the+road+to+obesity,+insulin+resistance+and+cardiovascular+disease+in+adults.">Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults.</a> Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).</li><li>Maxwell, P., Salnikow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+an+oxygen+and+metal+responsive+transcription+factor.">HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor.</a> Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).</li><li>Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+genes+encoding+glycolytic+enzymes+by+hypoxia-inducible+factor+1.">Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).</li><li>Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cobalt+inhibits+the+interaction+between+hypoxia-inducible+factor-alpha+and+von+Hippel-Lindau+protein+by+direct+binding+to+hypoxia-inducible+factor-alpha.">Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha.</a> J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).</li><li>Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+HIFs,+buts+and+maybes+of+hypoxia+signalling+in+disease:+lessons+from+zebrafish+models.">Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mimetic+agents+desferrioxamine+and+cobalt+chloride+induce+leukemic+cell+apoptosis+through+different+hypoxia-inducible+factor-1alpha+independent+mechanisms.">Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms.</a> Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).</li><li>Woods, I. G., Imam, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+severe+hypoxic+stress+during+development+in+zebrafish.">Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish.</a> Genom Data. 6, 83-88 (2015).</li><li>Rouhi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish.">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li><li>Stevenson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+disruption+of+vertebrate+CAN+pathfinding+through+EphrinB2+is+rescued+by+magnesium.">Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium.</a> PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).</li><li>Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-Deprived+Retinal+Progenitors+Proliferate+in+Response+to+Hypoxia:+Interaction+of+the+HIF-1+and+mTOR+Pathway.">Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway.</a> J Dev Biol. 4 (2), (2016).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).</li><li>McDonough, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Culture,+and+Analysis+of+Xenopus+laevis+Embryonic+Retinal+Tissue.">Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue.</a> JoVE. (70), (2012).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí hemos presentado un nuevo pero fácil método robusto para inducir hipoxia que se ajusta para su uso con los embriones de sapo y pez cebra, pero también puede ser adecuado para otros organismos acuáticos. La principal ventaja de este método reside en su simplicidad y rentabilidad. Sin embargo, los resultados obtenidos con este método son muy robustos. Hemos demostrado que la hipoxia puede ser inducida eficientemente en la cámara tanto en embriones enteros como en tejido específico - aquí, retinas. Para dete...

La investigación de la hipóxia tiene numerosas aplicaciones. Estos incluyen la investigación de la patogénesis y el desarrollo de tratamientos para condiciones médicas que se caracterizan por la hipoxia 1 y la enfermedad de alta altitud aguda 2 . El estrés hipóxico causa importantes cambios metabólicos en todos los organismos que requieren oxígeno. Estrés hipóxico también influye en el crecimiento fetal y el desarrollo y la patogénesis de varias enfermedades humanas, incluida la restricción de crecimiento intrauterino [ 3] . El estrés hipóxico puede no sólo conducir a la reducción del peso al nacer, la mortalidad fetal y neonatal, sino que también puede dar lugar a muchas complicaciones en la vida adulta, como las enfermedades cardiovasculares, la diabetes tipo 2, la obesidad y la hipertensión 4 . El estrés hipóxico también se observa a menudo durante el desarrollo del tumor sólido, cuando el tejido tumoral supera su suministro de sangre. Por lo tanto, es crucial para poder estudiar los efectos de la hipoxia in vivo y directamente durante el embrión<html> Desarrollo yónico. Entre los métodos más conocidos que se han empleado para estudiar los efectos de la hipoxia durante el desarrollo es el uso de cloruro de cobalto en el medio de crecimiento o la incubación del organismo en una cámara hipóxica. El cloruro de cobalto induce artificialmente una respuesta hipóxica bajo concentración normal de oxígeno, debido a su papel en la estabilización del factor-1 alfa inducible por hipoxia (HIF-1α) al prevenir su degradación proteosómica 5 , 6 , 7 . Sin embargo, siendo un método conveniente 8 , el uso de cloruro de cobalto así como otros similares miméticos de hipoxia química pueden tener un efecto deletéreo inespecífico en células y tejidos, por ejemplo , apoptosis 9 . Por lo tanto, las cámaras hipóxicas son un mejor método para la inducción de &quot;hipoxia natural&quot; en organismos vivos a través del desarrollo normal. Ntent &quot;&gt; Nos hemos centrado en el desarrollo de un sistema para la inducción de la hipoxia en los embriones de animales acuáticos.Las ranas y el pez cebra se han convertido en organismos informativos modelo de vertebrados para los estudios de numerosos procesos biológicos, así como los modelos de diversas enfermedades humanas. Además, un desarrollo rápido permite manipular factores ambientales y observar los cambios fenotípicos en la formación de órganos en tiempo real. Además, muchos componentes de las principales vías de transducción de señales están altamente conservados en Estos organismos modelo y se han caracterizado en detalle por un gran cuerpo de la literatura.La principal ventaja en el uso de ranas y embriones de pez cebra para estudiar los efectos de la hipoxia en el desarrollo de vertebrados es que todos los procesos pueden ser controlados directamente, ya que el oxígeno penetra rápidamente en los embriones. Así, en las ranas y el pez cebra, como en contraste con otros organismos modelo tales comoEmbriones de ratón, se puede estudiar la influencia de una concentración específica de oxígeno en el tejido de interés, sin tener en cuenta la presencia o ausencia de vasculatura funcional. La mayoría de las configuraciones comercialmente disponibles para la incubación hipóxica tienen la desventaja de ser comparativamente grandes y tener costes de funcionamiento correspondientemente altos. Aparte de su alto costo inicial y consumo de gas, el equilibrio y el mantenimiento de las cámaras comunes de hipoxia requiere el mantenimiento de una atmósfera hipóxica constante contra el gradiente de gas que ocurre naturalmente en estas cámaras debido a su mayor tamaño y / o respiración del organismo. Esto requiere el empleo de ventiladores de gas y un sistema de refrigeración, lo que aumenta la cantidad de equipo adicional necesario, impide la destreza del investigador y en general disminuye la simplicidad del procedimiento experimental. En contraste, la configuración que presentamos aquí es comparativamente robusta pero muy rentable, pequeña, fácil de establecer y permite fEquilibrio de gases, una atmósfera hipóxica estable y un simple intercambio de materiales y soluciones dentro de la cámara. Nuestro sistema puede emplearse para su uso con cualquier organismo modelo acuático de interés. Hemos construido una cámara hipóxica que es convenientemente pequeña y por lo tanto se puede colocar dentro de una incubadora de laboratorio común, lo que permite fácilmente procedimientos experimentales a cualquier temperatura específica. Proporcionando un control conveniente de la temperatura así como la concentración de oxígeno en el medio, la ventaja de nuestro sistema frente a las incubadoras de hipoxia comercialmente disponibles reside en su pequeño tamaño y rentabilidad. Por lo tanto, nuestra configuración puede establecerse utilizando suministros generales de laboratorio disponibles para la mayoría de los laboratorios de investigación y no requiere materiales caros. Además, nuestra instalación no genera calor, a diferencia de las incubadoras de hipoxia comercialmente disponibles, y permite su uso a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente que se colocan en una incubadora. El laSt es especialmente crítico para el trabajo con organismos de sangre fría tales como ranas y peces donde las tasas de desarrollo y metabólicas son fuertemente dependientes de la temperatura. Al ser muy rentable y de fácil construcción, nuestra cámara de incubación de gas es sin embargo muy versátil en el establecimiento de diversas condiciones hipóxicas o hiperóxicas, así como permite la administración rápida y fácil de diferentes medios y soluciones para un gran número de condiciones experimentales. Además, empleando una placa de 24 pocillos en lugar de platos de uso común o tanques de laboratorio 10 , 11 , 12 , nuestro sistema permite la observación y el tratamiento experimental de varias condiciones mutantes a la vez. Para controlar la correcta inducción de la hipoxia, hemos monitorizado los niveles de la proteína HIF-1 α por Western blot detección. Además, el número de células que proliferan antes y después de la incubaciónN en la cámara hipóxica se puede utilizar para determinar si se ha inducido hipoxia en el tejido. Este método se basa en nuestros resultados previamente publicados 13 , que muestran que la proliferación en el nicho embrionario de células madre retina disminuye a la inducción de la hipoxia. Por lo tanto, hemos monitoreado el nivel de proliferación de células madre retinianas añadiendo 5-etinil-2&#39;-desoxiuridina (EdU) al medio embrionario y midiendo su incorporación en el ADN de células que proliferan recientemente.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>0.1x MBS</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma</td><td>202967</td><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Embryo medium</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>CG10</td><td>Frog fertilization</td></tr><tr><td>Zebrafish breeding tank</td><td>Carolina</td><td>161937</td><td>Gas chamber construction</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>RS Components UK</td><td>Kit 199-1468</td><td></td></tr><tr><td>Gas distributor valve</td><td>WPI Luer Valves</td><td>Kit 14011</td><td>Aquatic tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>High precision gas valve</td><td>BOC&amp;nbsp;</td><td>200 bar HiQ C106X/2B</td><td>Gas tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;I&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>5% oxygen and 95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>BOC</td><td>226686-L</td><td>Hypoxic gas mixture</td></tr><tr><td>ceramic disc diffuser</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Art&amp;nbsp;</td><td>Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;J&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>silicone grease</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>VAC1100</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;K&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>oxymeter</td><td>Oxford Optronix&amp;nbsp;</td><td>Oxylite, CP/022/001</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>fibre-optic dissolved oxygen sensor</td><td>Oxford Optronix</td><td>HL_BF/OT/E</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>plastic pasteur pipette</td><td>Sterilin</td><td>STS3855604D</td><td>For embryo transfer</td></tr><tr><td>MS222&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Embryo anesthetic</td></tr><tr><td>RIPA buffer&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R0278-50ML</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>4x Laemmli loading buffer, 10x TBST</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td>10x TBST</td></tr><tr><td>skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td>Blocking Solution</td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge tube</td><td>Sigma</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>tissue homogenizer</td><td>Pellet Pestle Motor Kontes</td><td>Z359971</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>pellet pestles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>precast 12% gel</td><td>Biorad</td><td>Mini-ProteinTGX, 456-1043</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>protein ladder</td><td>Amersham</td><td>Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>nitrocellulose membrane (0.45 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-HIF-1&amp;alpha; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2185</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T6074</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-mouse antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97080</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Pierce ECL 2 reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>80196</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>ECL films Hyperfilm</td><td>GE Healthcare Amersham</td><td>28906837</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&amp;prime;-deoxyuridine &amp;nbsp;</td><td>santa cruz</td><td>CAS&amp;nbsp;61135-33-9</td><td>EdU, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>1x</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Fixation solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fluka</td><td>S/8600/60</td><td>Solution solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>PBST</td></tr><tr><td>Heat-inactivated Goat Serum (HiGS)</td><td>Sigma</td><td>G6767-100ml</td><td>Blocking solution (EdU incorporation)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation</td></tr><tr><td>glass vial</td><td>VWR</td><td>98178853</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&amp;nbsp;</td><td>Scigen</td><td>4563</td><td>Embedding medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>cryostat Jung Fridgocut 2800E</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3035S</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>EdU Click-iT chemistry kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>FluorSave</td><td>Calbiochem</td><td>D00170200</td><td>Mounting medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr></tbody></table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

Aquí, introducimos un nuevo sistema para la inducción de hipoxia, que desarrollamos para estudiar los efectos de la hipoxia en organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema comprende una cámara con una instalación sencilla pero que es, sin embargo, robusta para inducir y mantener una concentración específica de oxígeno y temperatura en cualquier solución experimental de elección. El sistema presentado es muy rentable pero altamente funcional, permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia para experimentos directos in vivo y durante varios periodos de tiempo de hasta 48 h. Para monitorear y estudiar los efectos de la hipoxia, se han empleado dos métodos - la medición de los niveles de hipoxia inducible factor 1alfa (HIF-1α) en embriones enteros o tejidos específicos y la determinación de la proliferación de células madre retinianas por 5-etinil-2&#39;- Desoxiuridina (EdU) en el ADN. Los niveles de HIF-1 alpha pueden servir como un marcador general de hipoxia en todo el embrión o tejidoDe elección, aquí la retina embrionaria. La incorporación de EDU en las células proliferantes de la retina embrionaria es un resultado específico de la inducción de hipoxia. Por lo tanto, hemos demostrado que hypoxic progenitores de la retina embrionaria disminuir la proliferación dentro de 1 h de incubación en el 5% de oxígeno de la rana y el pez cebra embriones. Una vez dominado, nuestro sistema se puede emplear para el uso con micro organismos acuáticos pequeños, para experimentos directos in vivo , en cualquier período de tiempo dado y bajo concentración de oxígeno normal, hipóxico o hiperóxico o bajo cualquier otra mezcla de gases dada.

El empleo del sistema de cámara hipóxica que aquí se presenta permite estudiar los efectos de la hipoxia individualmente e in vivo en animales vivos enteros. La hipoxia puede ser inducida colocando embriones enteros de sapo o pez cebra en la cámara hipóxica ( Figura 1 ), y realizarse en diferentes combinaciones de condiciones. En la Figura 2 se muestra una imagen de nuestra instalación completa de la cámara de ga...

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Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Introducimos un nuevo sistema de cámara hipóxico para su uso con organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema es simple, robusto, rentable y permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia in vivo y hasta 48 horas. Presentamos 2 métodos reproducibles para monitorear la efectividad de la hipoxia.

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K vistas.  University of Cambridge.  Introducimos un nuevo sistema de cámara hipóxico para su uso con organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema es simple, robusto, rentable y permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia in vivo y hasta 48 horas. Presentamos 2 métodos reproducibles para monitorear la efectividad de la hipoxia. 

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biología

Investigando el desarrollo de la manipulación de la señalización optogenética en el pez cebra

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Autor destacado: Manipulación de la señalización en embriones de pez cebra para decodificar las decisiones sobre el destino de las células 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Desencadenar el estrés celular y la muerte Uso convencional UV láser confocal Microscopía

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Neurociencias

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Resumen

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Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Desencadenar el estrés celular y la muerte Uso convencional UV láser confocal Microscopía

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra