Este protocolo se puede utilizar para aplicar un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación de espermatozoides. Desarrollamos este protocolo para comparar los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real entre espermatozoides de ratón no capacitados y capacitados. El día antes del ensayo, retire el cartucho del sensor de un kit de ensayo de flujo extracelular y coloque el cartucho boca abajo junto a la placa de utilidad.
Llene un depósito de solución con 25 mililitros de agua destilada doble y agregue 200 microlitros de agua a cada pozo de la placa de servicio, luego coloque el cartucho del sensor de nuevo en la placa de servicio. Coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius. A continuación, aliquot 25 mililitros de calibrador de flujo extracelular en un tubo cónico de 50 mililitros y coloque el tubo en la incubadora de dióxido de carbono no carbono de 37 grados Celsius.
Para preparar microplacas recubiertas con ConA, disolver 2,5 miligramos de ConA en cinco mililitros de agua doble destilada y utilizar una pipeta multicanal para llenar cada pozo de un analizador de flujo extracelular de placa de 96 pozos con 50 microlitros de la solución ConA, luego dejar la tapa abierta para dejar la placa seca durante la noche. Para preparar el tampón de espermatozoides, calienta 250 mililitros del analizador de flujo extracelular TYH buffer a 37 grados Celsius y ajusta el pH a 7.4. El día del ensayo, sustituya el agua de cada pozo de la placa de servicios públicos por 200 microlitros de calibrador XF por pozo y vuelva a colocar la placa en la incubadora de dióxido de carbono no carbono durante al menos una hora.
Para generar una plantilla de onda, active el analizador de flujo extracelular. Mientras la temperatura se está estabilizando a 37 grados Celsius, abra el software de onda y abra una plantilla en blanco. En la pestaña de definiciones de grupo, defina el medio de ensayo como TYH y el tipo de celda como esperma de ratón, dejando las estrategias de inyección y los pretratamientos en blanco.
Cree diferentes grupos para cada condición de ensayo y abra el mapa de placas para asignar cada grupo a pozos específicos. En la pestaña protocolo, unhighlight equilibrate, agregue cada uno de los cuatro ciclos de medición diferentes, seleccione el puerto respectivo y edite los detalles de medición para que se resalte la medida después de la inyección, luego guarde la plantilla de ensayo, rellene el resumen del proyecto y guarde los resultados. Antes de cosechar el esperma, precalienta 50 mililitros de tampón TYH a 37 grados Celsius.
Después de cosechar caudas de ratones machos adultos, coloque cada cauda en 500 microlitros del tampón TYH precalentó en pozos individuales de un plato de 24 pozos. Utilice fórceps para inmovilizar cada cauda individualmente en la parte inferior de cada pozo y rápidamente haga de cinco a siete pequeñas incisiones en cada tejido usando tijeras de plumas. Cuando todas las caudas hayan sido incedidas, coloque inmediatamente la placa en la incubadora de dióxido de carbono no carbono para permitir que los espermatozoides se dispersen durante 15 minutos.
Para cargar el cartucho del sensor, retire la tapa del cartucho del sensor y alinee la letra de la guía de carga del puerto correspondiente con la esquina superior izquierda del cartucho. Manteniendo la guía de carga del puerto en su lugar, inserte las puntas de la pipeta verticalmente en los orificios de la guía de carga del puerto A e inyecte 20 microlitros de búfer TYH en cada columna. Para el puerto B, inyecte 22 microlitros de tyH buffer en las columnas uno a cuatro, 22 microlitros de 500 mililitros de 2-desoxiglucosa en columnas de cinco a ocho, y 25 microlitros de cinco antimicina micromolar A rotenona en columnas nueve a 12.
Para el puerto C, inyecte 25 microlitros de tyH buffer en cada columna con números impares y 25 microlitros de 10 mililitros de DIbutyryl-cyclic AMP 500 micromolar IBMX en cada columna con números pares, luego coloque el cartucho del sensor con una placa de calibración en el analizador de flujo extracelular e inicie el ensayo. La calibración tardará de 10 a 15 minutos. Para preparar las placas de esperma, agregue tres mililitros de tres miligramos por mililitro de albúmina sérica bovina en tampón TYH a cada uno de los tres tubos centrífugos de cinco mililitros.
A continuación, a la continuación, la piscina de dos pozos de espermatozoides en cada uno de los tres tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. Después de contar, diluir el esperma a un dos veces 10 a la concentración de siete espermatozoides por mililitro por muestra en TYH fresco complementado con albúmina sérica bovina. Sedimentar el esperma por centrifugación y resuspender los gránulos de espermatozoides en un mililitro de tampón TYH.
Centrifugar el esperma de nuevo y eliminar los sobrenadantes teniendo cuidado de no molestar los gránulos. Transfiera cada suspensión de espermatozoides a uno de los tubos de centrífuga de cinco mililitros preparados y agregue 180 microlitros de tampón TYH en cada pozo de esquina de una placa recubierta con ConA. Añadir 180 microlitros de esperma en cada pozo vacío de la placa recubierta de ConA y centrifugar la placa dos veces girando la placa 180 grados entre centrifugaciones, luego coloque la placa de calibración con la placa de esperma y continúe el ensayo.
En este experimento representativo, los espermatozoides se capacitaron en presencia de glucosa como el único sustrato de energía y 2-desoxiglucosa y antimicina y rotenona como moduladores farmacológicos. La flecha indica la inducción de la capacitación. En presencia de glucosa, la capacitación fue acompañada por un aumento de siete veces en la tasa de acidificación extracelular que se inhibe por el bloqueo de la glucólisis con 2-desoxiglucosa.
Los espermatozoides capacitados demostraron un aumento de 20 veces en la tasa de consumo de oxígeno en comparación con los espermatozoides no capacitados que demuestran que los espermatozoides del ratón mejoran tanto la glucólisis como la fosforilación oxidativa para apoyar la creciente demanda de energía durante la capacitación. El aumento de la tasa de acidificación extracelular durante la capacitación de espermatozoides no se ve afectado por los inhibidores de la fosforilación oxidativa antimicina A y la rotenona, lo que indica que el cambio en esta tasa es impulsado principalmente por la liberación de hidrógeno de la glucólisis. El aumento en la tasa de consumo de oxígeno, sin embargo, está bloqueado por la antimicina A y la rotenona, así como por la 2-desoxiglucosa revelando que el aumento de OXPHOS durante la capacitación de espermatozoides depende de la actividad glucolítica.
La fuente de energía y los activadores e inhibidores farmacológicos pueden variar dependiendo del objetivo del experimento y hasta 12 condiciones diferentes se pueden medir en paralelo. El protocolo se puede adaptar fácilmente a otras especies como la humana o la bovina donde los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación son igualmente enigmáticos.
