Los cambios metabólicos en el tallo hematopoyético y las células progenitoras les permiten pasar de su estado de reposo a un estado de diferenciación para sostener las demandas de formación de sangre. La alteración en la plasticidad metabólica del tallo hematopoyético y las células progenitoras conduce a trastornos hematológicos. Nuestro protocolo ayudará a medir la regulación metabólica y la salud del tallo hematopoyético y las células progenitoras durante el desarrollo sanguíneo y las enfermedades.
El análisis de la respiración mitocondrial y la glucólisis de células madre y progenitoras hematopoyéticas es difícil, ya que son poblaciones frágiles y raras. Nuestro protocolo optimizado permite el aislamiento de una mayor cantidad de células madre y progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea murina, mejora su viabilidad durante la incubación, facilita el análisis de flujo extracelular de HSPC no adherentes y proporciona parámetros de inyección optimizados para la fosforilación oxidativa dirigida a fármacos, así como vías glucolíticas. Para comenzar este procedimiento, llene los pozos de la placa de servicios públicos y las cámaras alrededor de los pozos con agua estéril.
Sumerja el cartucho del sensor en la placa de servicio asegurándose de que los sensores estén completamente cubiertos por agua. A continuación, coloque el cartucho sumergido en la placa de servicio en una incubadora no CO2 a 37 grados centígrados para incubar durante la noche. En un gabinete de bioseguridad de clase II, agregue 40 microlitros de solución de 0,1% PLL disponible comercialmente a cada pozo de la placa de ensayo.
Cubra la placa de ensayo con la tapa incluida en el kit e incubar la placa cerrada a temperatura ambiente bajo el capó durante una hora. Después de esto, utilice un aspirador estéril a base de vacío para eliminar el exceso de solución y secar al aire la placa debajo del capó. Para cosechar células de médula ósea murina mononucleadas, agregue cinco mililitros de gradiente de densidad medio a un tubo cónico de 15 mililitros.
Agregue lentamente cinco mililitros de la suspensión de la célula de la médula ósea asegurándose de que las células permanezcan como una capa por encima del medio de gradiente de densidad. Centrifugar a 500 g y a temperatura ambiente durante 30 minutos asegurándose de que la centrífuga esté en la aceleración más baja posible. Cosecha la interfaz media de las células mononucleadas en un tubo fresco de 15 mililitros.
Luego lave las células con cinco mililitros de 1X PBS que contengan 2%FBS. Centrifugar a 500 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resuspendir las células en 300 microlitros de 1X PBS que contienen 2%FBS.
A continuación, alícuota 10 microlitros de la suspensión celular para un control no manchado o de un solo color en un tubo FACS. Para cosechar HSPC LSK a partir de células de médula ósea murina mononucleadas, agregue 15 microlitros de cóctel de anticuerpos de biotina a 300 microlitros de células mononucleadas de médula ósea. Para cosechar HSPC LSK a partir de células de médula ósea murina mononucleadas, agregue 15 microlitros de cóctel de anticuerpos de biotina a 300 microlitros de células mononucleadas de médula ósea.
Coloque los tubos en un cubo de hielo colocado en una coctelera en un refrigerador para incubar a cuatro grados centígrados con agitación durante 30 minutos. Luego agregue 10 mililitros de 1X PBS pre-enfriado que contengan 2%FBS a las células. Centrifugar a 500 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en 400 microlitros de 1X PBS que contengan 2%FBS. Vórtice brevemente las micropersiones antibiotinas antes de su uso. Agregue 80 microlitros de las microperlas a cada muestra y mezcle bien.
Incubar durante 20 minutos adicionales a cuatro grados centígrados con agitación. Después de esto, agregue 10 mililitros de PBS pre-enfriado que contiene 2%FBS a las células. Centrifugar el tubo a 500 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en un mililitro de PBS que contenga 2%FBS. Almacene la suspensión celular a cuatro grados centígrados mientras configura la unidad de separación magnética. Coloque la columna en un campo magnético para el separador de clasificación de células asistidas magnéticas a cuatro grados centígrados.
Prepare la columna para la separación magnética enjuagando con tres mililitros de 1X PBS que contienen 2%FBS bajo flujo de gravedad a cuatro grados Celsius. Agregue la suspensión celular a la columna pre-húmeda a cuatro grados Centígrados. Permita que todas las células pasen a través de la columna a cuatro grados Celsius y recojan el efluente en un tubo cónico de 15 mililitros.
A continuación, lave la columna con tres mililitros de 1X PBS y 2%FBS a cuatro grados centígrados. Repita este lavado tres veces. Recoger el flujo a través y mantenerlo en cuatro grados Celsius.
Centrifugar el tubo cónico que contiene el flujo a través de 500 veces g y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 0,5 mililitros de 1X PBS con 2%FBS y transfiera la suspensión a un tubo FACS. Luego agregue 24 microlitros del cóctel de anticuerpos LSK a cada 10 millones de células.
Cubrir el tubo con papel de aluminio e incubar en la oscuridad a cuatro grados Celsius con agitación durante una hora. Después de esto, agregue tres mililitros de 1X PBS con 2%FBS al tubo FACS. Centrifugar a 500 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y resuspendir las células etiquetadas con anticuerpos en un mililitro de 1X PBS que contenga 2%FBS. Justo antes de ordenar, agregue un microlitro de un miligramo por mililitro de yoduro propidium a la suspensión celular y utilice un colador de 40 micrómetros para filtrar el contenido del tubo FACS. En primer lugar, centrifugar las células LSK recogidas a 500 veces g y a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Desechar el sobrenadante y resuspender las células en medios completos a una concentración final de al menos 70.000 células por cada 40 microlitros. Semilla 40 microlitros de esta suspensión celular en los pozos de una placa de ocho pozos recubierta de PLL asegurándose de dejar todos los pozos de esquina vacíos. Centrifugar la placa a 450 g y a temperatura ambiente durante un minuto.
Utilice un microscopio invertido para asegurarse de que las células están unidas a la parte inferior de los pozos. Después de esto, añadir 135 microlitros de medios completos a las células en cada pozo llevando el volumen final de cada pozo a 175 microlitros. Agregue 175 microlitros de medios completos a las dos esquinas de la placa como espacios en blanco.
Incubar las células en una incubadora no CO2 a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, configure un programa para que el analizador agregue medicamentos a cada pozo de la placa como se describe en la tabla dos y en la tabla tres del protocolo de texto. Para la prueba de esfuerzo mitocondrial, recupere el cartucho del sensor en la placa de identificación de la incubadora de modo que cada pozo tenga una concentración final de dos micromolares de oligomicina, 1,5 micromolarES FCCP y 0,5 micromolares de rotenona y anti-micina A según sea necesario.
Retire la tapa del cartucho del sensor y colóquela en la bandeja de instrumentos. Comience el proceso de calibración que tardará 20 minutos. Una vez completada la calibración, retire la placa de utilidad y sustitúyela por la placa de ensayo que contiene las celdas LSK.
Pulse Continuar para iniciar el programa previamente establecido. Una vez completado el programa, recupere los datos y analícelos. En este estudio, se aísla una cantidad máxima de HSPC de LSK murina viable y su glucólisis y metabolismo mitocondrial se mide con un analizador de flujo extracelular.
Aunque el análisis de flujo extracelular se utiliza tradicionalmente para las células adherentes, este método hace que los HSPC LSK se adhieran a los pozos recubiertos con PLL, lo que permite medir el flujo extracelular y, por lo tanto, la salud metabólica de los HSPC LSK. Con el fin de medir la respiración mitocondrial a través de la tasa de consumo de oxígeno y la glucólisis a través de la tasa de acidificación extracelular en condiciones basales y de estrés, los fármacos que interfieren con la glucólisis y la respiración mitocondrial se inyectan secuencialmente. Como era de esperar, el nivel basal de la tasa de acidificación extracelular es mayor para los HSPC LSK cultivados en medios positivos de glucosa y piruvato en comparación con los cultivados en medios negativos.
La inyección con glucosa no cambió la tasa de acidificación extracelular para las células cultivadas en los medios positivos, pero aumentó la glucólisis de las células en medios negativos. Sin embargo, el nivel basal de estas células seguía siendo menor en el grupo positivo. La inyección con oligomicina activó la glucólisis en su nivel máximo en el grupo positivo, pero no afectó al grupo negativo.
La inyección con el análogo de glucosa a 2 DG devolvió la tasa de acidificación extracelular a niveles no glucolíticos. Para la prueba de esfuerzo mitocondrial, la inyección de oligomicina hiperpolarizó la membrana mitocondrial impidiendo un mayor bombeo de protones a través de los complejos etc y reduciendo así la tasa de respiración mitocondrial. La inyección de FCCP lleva la tasa de consumo de oxígeno al máximo a medida que las células tratan de recuperar el potencial de la membrana mitocondrial.
La inyección con otros dos inhibidores de la cadena de transporte de electrones hace que la respiración mitocondrial se detenga por completo y, por lo tanto, la tasa de consumo de oxígeno volvió a su nivel mínimo. Evite el uso de búfer de lelisis de celda roja para el aislamiento de celda mononuclear. Recomendamos la separación de gradiente Ficoll para evitar la formación de grumos y reducir la pérdida de LSK.
Utilizando nuestro método optimizado, podemos medir la respiración mitocondrial y la glucólisis de células madre y progenitoras hematopoyéticas raras y frágiles y el estudio de señales metabólicas regulan la hematopoyesis normal y maligna.
