Interacciones in vivo entre proteínas FPOP y cambios en la estructura proteica en C-elegans. Estos animales son ampliamente utilizados como un sistema modelo para estudiar enfermedades humanas. Al acoplar el FPOP in vivo a la espectrometría de masas, podemos sondear interacciones proteínas-proteínas dentro de diferentes compartimentos celulares y corporales en un animal vivo sin necesidad de aislar una proteína en particular.
Comience el ensamblaje del sistema de flujo, cortando una pieza de dos centímetros de etileno propileno fluorado o tubo FPP. Utilice una aguja de disección limpia para ensanchar el diámetro interior en un extremo del tubo, creando un pequeño cráter de unos 15 milímetros de longitud. Para crear las líneas infundidas del sistema de flujo, corte hasta 15 centímetros de sílice fundida de 250 micrómetros de diámetro interior con una cortadora de cerámica.
Y pegue los dos capilares junto con la cinta autoadhesiva, asegurándose de que los extremos estén 100% lavados. Inserte los dos capilares en el cráter del tubo FPP, empujándolos hasta el borde mismo. Coloque un pequeño punto de resina epoxi sobre una superficie limpia y mezcle con la aguja diseccionada.
Utilice la misma aguja para colocar rápidamente una pequeña gota de la resina, al final de los capilares infundidos, donde se conectan con el tubo FPP, permiten que la resina se seque el lado de salida durante unos minutos. Mientras tanto, corte un nuevo capilar de 250 micrómetros de diámetro interior que se convertirá en el capilar de salida del sistema de flujo. Una vez que la resina se haya secado, inserte el nuevo capilar en el extremo de salida del tubo FPP.
Los extremos interiores del capilar de salida y los dos capilares infundidos deben estar enjuagados entre sí, creando el té de mezcla. Enlazar al tubo capilar y FPP con resina epoxi fresca como se describió anteriormente, y permitir que el sistema de flujo se seque durante la noche. Inserte cuatro agitadores magnéticos, dentro de una jeringa de cinco mililitros que evitará que los gusanos se asienten en esta jeringa durante la oxidación fotoquímica rápida in vivo de proteínas o el FPOP in vivo.
Llene esta y una jeringa adicional de cinco mililitros con M9, asegurándose de evitar la creación de burbujas. Conecte un adaptador inferior a cada jeringa, asegurándose de que estén apretados con los dedos y asegurados en su lugar. A continuación, conecte cada jeringa al puerto central de una sola válvula de tres a dos.
Fije cada jeringa a la bomba de jeringa doble y ajuste el color mecánico para evitar la sobrepresión del bloque del empujador. Utilice una lista de super bridas que no sea la variable de la lista de manguitos y super bridas para conectar cada extremo capilar infundido del sistema microfluídico previamente fabricado al puerto superior de cada válvula de tres a dos. Por último, conecte un capilar de 10 centímetros 450 micrómetros de diámetro interior al puerto inferior de la válvula, que servirá como capilar de la muestra de retirada.
Encienda el flujo de la bomba e inspeccione visualmente todas las conexiones en busca de fugas. Fluya al menos tres volúmenes de jeringa utilizando el caudal experimental. La trayectoria de flujo está marcada por las flechas en el mango de tres-dos válvulas, y cada jeringa se puede rellenar manualmente moviendo el mango de la válvula de expulsión a posición de retirada.
Después de inspeccionar el sistema de flujo microfluídico, muévalo al banco experimental y fije el capilar de salida a la etapa radiante con una unión de acero inoxidable. Utilice un encendedor de largo alcance para quemar el recubrimiento de la sílice fundida en la ventana de irradiación láser y limpiar el recubrimiento quemado con tejido de pelusa y metanol. Coloque el bloque del agitador magnético por encima de la jeringa con los agitadores magnéticos y ajuste la velocidad, de modo que los agitadores giren lenta y constantemente.
Encienda el láser de excimer de flúor de Krypton y permita que el tron tiroideo se caliente. Mida la energía láser a una frecuencia de 50 hercios durante al menos 100 pulsos colocando el sensor óptico en la ventana de salida del haz. Retire manualmente aproximadamente 10.000 gusanos en un volumen de 500 microlitros en la jeringa de muestra.
A continuación, llénelo con 2,5 mililitros del tampón M9, asegurándose de evitar las burbujas de aire. Es importante tener un tamaño de muestra de al menos 10.000 gusanos. Un tamaño de muestra más pequeño resultará en un bajo rendimiento proteico para el análisis proteómico posterior.
Llene la segunda jeringa con tres mililitros de peróxido de hidrógeno de 200 milimolar. Al final del capilar de salida, coloque un tubo cónico de 15 mililitros con seis mililitros de 40 MILilitros DMTU, 40 PLIólilo mililolar y 1% de óxido de manzana. Inicie el láser excimer desde la ventana del software, espere el primer pulso e inicie el flujo de muestra desde la jeringa doble.
Recoja toda la muestra en el tubo de 15 mililitros, mientras monitorea activamente el flujo de la muestra en busca de fugas visuales. Después de FPOP in vivo, pele el gusano por centrifugación a 805 veces g durante dos minutos. Aspirar la solución de enfriamiento y añadir 250 microlitros de búfer con licencia.
Transfiera la muestra a un tubo de micro centrífuga limpio, congele el flash y guárdelo a 80 grados Celsius negativos hasta la digestión de la muestra. la recuperación del gusano se comparó después de FPOP in vivo utilizando capilares con dos diámetros internos diferentes. Cuando se utilizó un capilar de 250 micrómetros de diámetro interno, se logró una recuperación total de la muestra entre el 63 y el 89% en dos réplicas biológicas.
El uso de un capilar de 150 micrómetros de diámetro interior dio lugar a sólo una recuperación de 21 a 31%. El uso de un capilar de mayor diámetro interno, conduce a un mejor flujo de gusanos durante el FPOP in vivo, el capilar más pequeño no permite un solo flujo de gusanos, y se ven múltiples gusanos fluyendo juntos en la ventana radiante láser, lo que disminuye la cantidad de exposición láser por gusano. Los cromatogramas iónicos extraídos representativos de un péptido modificado y no modificado por FPOP mostraron que el radical hidroxilo cambia la química de los péptidos modificados oxidativamente haciéndolos más polares.
En la cromatografía de fase inversa, los péptidos modificados FPOP in vivo tienen tiempos de retención anteriores que los péptidos no modificados. La fragmentación de la EMIN de péptidos aislados, permite la identificación de residuos modificados oxidativamente. El FPOP in vivo ha modificado oxidativamente un total de 545 proteínas en dos réplicas biológicas dentro de los C-elegans.
Una ventaja de este método de lancha de proteínas, es su capacidad para modificar proteínas, en una variedad de sistemas corporales dentro de los gusanos. El análisis Tándem MS confirma in vivo la accesibilidad del disolvente de la sonda FPOP in vivo. Se analizó el patrón de oxidación de la proteína de choque térmico 90 en complejo con la proteína de chaperona de miosina UNC 45, y se encontraron cuatro residuos modificados oxidativamente.
El uso de C-elegans para el FPOP in vivo, ofrece el potencial de estudiar el papel de las interacciones proteína-proteína y la estructura proteica en la patogénesis de la enfermedad.
