FPOP en células junto con la espectrometría de masas es una nueva y poderosa técnica utilizada para estudiar las interacciones de proteínas proteicas y los cambios estructurales de proteínas en las células vivas. Con FPOP en células, no es necesario aislar proteínas de interés, sino que puede estudiarlas en sus entornos nativos. Esto es particularmente útil para las proteínas de membrana.
Con este método, puede estudiar los cambios en las interacciones de la estructura y las proteínas en una variedad de enfermedades, incluyendo el cáncer y trastornos genéticos, para que pueda entenderlos y caracterizarlos mejor. Para comenzar el montaje del sistema de flujo, utilice una piedra de escote para cortar el tubo de sílice fusionado a los tamaños adecuados. A continuación, coloque seis pequeños imanes cilíndricos en una jeringa de 500 microlitros y llene la jeringa, una segunda jeringa de 500 microlitros y dos jeringas de cinco mililitros con tampón de vaina.
Después de extraer el aire, coloque las jeringas en la bomba de la jeringa y apriete el tapón de la bomba de la jeringa para que la jeringa de la célula tenga aproximadamente 50 microlitros que quedan cuando el motor se detenga. Usando un adaptador de señuelo, conecte una válvula manual a cada jeringa y ensamble el tubo de sílice como se ilustra, asegurándose de enhebrar la célula más la línea de sílice de peróxido de hidrógeno a través de la cruz e insertarla directamente en la línea de sílice 450 ID. Cuando todo el tubo se haya conectado, coloque el sistema de flujo junto a un láser y utilice un encendedor para quemar el recubrimiento de sílice en el tubo de 450 micrómetros de diámetro interior para hacer una ventana para la irradiación láser.
Coloque un agitador magnético por encima de la jeringa celular que contiene los seis imanes y coloque la bomba de la jeringa en 492,4 microlitros por minuto para un caudal final de 1083,3 microlitros por minuto. Búfer de flujo a través del sistema tres veces para vaciar el sistema, comprobando cada conexión en busca de fugas. Utilice una lente convexa para enfocar el láser excimer en el tubo de sílice.
Para probar la ventana de irradiación, coloque un pequeño trozo de papel detrás del tubo de sílice y encienda el láser. A continuación, mida la región quemada de la irradiación y utilice la ventana de irradiación y el caudal para calcular la frecuencia láser necesaria para obtener una fracción de exclusión de cero. Para recoger las células para el procedimiento, lave las células de un cultivo de matraz T175 de 70 a 90% confluente con una solución de sal adecuada para el cultivo celular.
Resuspender las células en 10 mililitros de tampón para contar y recoger las células por centrifugación. Es fundamental contar las celdas para asegurarse de que son suficientes para el análisis descendente, pero no demasiadas para hacer que se agreguen y obstruyan el sistema de flujo. Luego resuspender las células a un dos veces 10 a las sextas células por mililitro de concentración de tampón de vaina y aliquot las células en un volumen de 500 microlitros por muestra.
Para FPOP en la célula, llene las dos jeringas de cinco mililitros con tampón de vaina fresca, la jeringa de 500 microlitros que contiene los imanes con una alícuota de células y la jeringa final de 500 microlitros con peróxido de hidrógeno recién preparado de 200 mililitros. Encienda el agitador magnético y piga en 220 microlitros de dimetil sulfóxido a una alícuota de Quench. Después de una mezcla suave, coloque el Quench detrás del sistema de flujo para recoger las muestras irradiadas y encender el láser.
Después de siete segundos, encienda el sistema de flujo. Una vez que la muestra termine de fluir, apague el láser y mezcle suavemente el Quench con la muestra recogida. A continuación, llene las cuatro jeringas con tampón fresco y enjuague el búfer a través del sistema de flujo.
Después de que el sistema termine de enjuagar, repita el procedimiento con una nueva alícuota de células y soluciones sin irradiación como el control sin láser para tener en cuenta la oxidación de fondo dentro de las células. Mientras se ejecuta la siguiente muestra, centrifugar la primera muestra y resuspender el pellet en 100 microlitros de un búfer de lyis celular apropiado. A continuación, transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga para la congelación de flash en nitrógeno líquido.
Cuando todas las muestras hayan terminado de funcionar, desmonte el sistema de flujo y deseche el tubo de sílice usado. Luego, limpie todas las demás conexiones por sonicación durante una hora en una solución de 50%agua 50%metanol. Después de aislar y digerir las proteínas del lisato celular de acuerdo con los protocolos estándar, analice el lisato celular digerido de acuerdo con los protocolos LCMS en tándem estándar para localizar la modificación FPOP en todo el protio.
A continuación, cargue los datos en un programa de software de análisis de proteínas adecuado y analice los datos con una base de datos de proteínas relevante y la enzima digesta relevante. Una vez que los archivos hayan terminado de buscar, calcule la extensión de la oxidación de FPOP en la proteína de interés. Las imágenes de fluorescencia de imágenes apiladas ortogonales YZ muestran una separación clara del búfer de vaina de la solución celular a medida que fluye más allá de la ventana de irradiación láser.
Se pueden generar mapas de calor promedio tridimensionales del búfer de vaina o la solución de celda para ilustrar la mezcla mínima de las dos soluciones. El uso del sistema de flujo de una sola célula aumenta el número de proteínas modificadas oxidativamente en 13 veces. Para confirmar la modificación de las proteínas de interés dentro de las células intactas, se pueden realizar imágenes de fluorescencia después del tratamiento e irradiación de peróxido de hidrógeno.
Usando espectrometría de masas en tándem, estas modificaciones se pueden localizar aún más a aminoácidos específicos en una proteína. El cambio observado en este cromatograma iónico extraído se traduce en el cambio en la hidrofobicidad causado por la metionina oxidada en el péptido modificado. La comparación de actina etiquetada en célula por huella in vitro revela niveles similares de oxidación, lo que indica que la actina tiene una accesibilidad de disolvente similar para estudios tanto en células como in vitro.
Además, la comparación de la extensión de la rápida oxidación fotoquímica de las modificaciones de la proteína de interés a la accesibilidad del disolvente, los residuos etiquetados calculados a partir de dos estructuras cristalinas de actina demuestra que la oxidación fotoquímica rápida en las células de la proteína de interés sondea eficientemente la accesibilidad del disolvente de la proteína monomérica. Hay varios pasos adicionales que uno puede tomar para aumentar la detección de las modificaciones abundantes más bajas de FPOP, incluyendo cromatografía 2D, fraccionamiento subcelular y técnicas de multiplexación proteómica. Con el uso de FPOP en células, ahora podemos realizar biología proteomiostructural para conectar mejor las estructuras proteicas con la función celular.
Debido a la longitud de onda de 248 nanómetros requerida para FPOP, asegúrese de usar siempre gafas protectoras UV y ropa adecuada para evitar la exposición involuntaria a la radiación reflejada o dispersa.
