L'FPOP in-cell accoppiato con la spettrometria di massa è una nuova potente tecnica utilizzata per studiare le interazioni proteiche proteiche e i cambiamenti strutturali proteici nelle cellule viventi. Con fpop in-cell, non è necessario isolare le proteine di interesse, ma piuttosto studiarle nei loro ambienti nativi. Questo è particolarmente utile per le proteine di membrana.
Con questo metodo, è possibile studiare i cambiamenti nella struttura e nelle interazioni proteiche proteiche in una varietà di malattie, tra cui il cancro e i disturbi genetici, in modo da poterli comprendere e caratterizzare meglio. Per iniziare l'assemblaggio del sistema di flusso, utilizzare una pietra di scissione per tagliare i tubi di silice fusi alle dimensioni appropriate. Quindi, posizionare sei piccoli magneti cilindrici in una siringa da 500 microlitri e riempire la siringa, una seconda siringa da 500 microlitri e due siringhe da cinque millilitri con tampone di suonerie.
Dopo aver rimosso l'aria, posizionare le siringhe sulla pompa della siringa e stringere il tappo della pompa della siringa in modo che la siringa cellulare abbia circa 50 microlitri rimasti quando il motore si blocca. Utilizzando un adattatore per esca, collegare una valvola manuale a ciascuna siringa e assemblare i tubi di silice come illustrato, assicurandosi di infilare la cella più la linea di silice di perossido di idrogeno attraverso la croce e inserirla direttamente nella linea di silice a 450 ID. Quando tutti i tubi sono stati collegati, posizionare il sistema di flusso accanto a un laser e utilizzare un accendino per bruciare il rivestimento di silice sui tubi di diametro interno da 450 micrometri per creare una finestra per l'irradiazione laser.
Posizionare un agitatore magnetico sopra la siringa cellulare contenente i sei magneti e impostare la pompa della siringa su 492,4 microlitri al minuto per una portata finale di 1083,3 microlitri al minuto. Flow buffer attraverso il sistema tre volte per scaricare il sistema, controllando ogni connessione per eventuali perdite. Utilizzare una lente convessa per mettere a fuoco il laser ad eccimeri sul tubo di silice.
Per testare la finestra di irradiazione, posizionare un piccolo pezzo di carta dietro il tubo di silice e accendere il laser. Quindi, misurare la regione bruciata dall'irradiazione e utilizzare la finestra di irradiazione e la portata per calcolare la frequenza laser necessaria per ottenere una frazione di esclusione pari a zero. Per raccogliere le cellule per la procedura, lavare le cellule da una coltura di pallone T175 confluente dal 70 al 90% con una soluzione salina appropriata di grado di coltura cellulare.
Rimospendare le cellule in 10 millilitri di tampone per il conteggio e raccogliere le cellule per centrifugazione. È fondamentale contare le celle per assicurarsi che siano sufficienti per l'analisi downstream, ma non troppe per farle aggregare e ostruire il sistema di flusso. Quindi rimospendare le cellule a due per 10 alla sesta cellule per millilitro di concentrazione di tampone di sheath e aliquotare le cellule in un volume di 500 microlitri per campione.
Per l'FPOP in cella, riempire le due siringhe da cinque millilitri con tampone di foche fresche, la siringa da 500 microlitri contenente i magneti con un'aliquota di cellule e l'ultima siringa da 500 microlitri con perossido di idrogeno da 200 millimolare preparato al momento. Accendere l'agitatore magnetico e il picco in 220 microlitri di solfossido di dimetile a un'aliquota di Quench. Dopo una miscelazione delicata, posizionare il tempra dietro il sistema di flusso per raccogliere i campioni irradiati e accendere il laser.
Dopo sette secondi, accendere il sistema di flusso. Una volta terminato il flusso del campione, spegnere il laser e mescolare delicatamente il tempra con il campione raccolto. Quindi, riempire tutte e quattro le siringhe con un tampone fresco e sciacquare il buffer attraverso il sistema di flusso.
Al termine del lavaggio del sistema, ripetere la procedura con una nuova aliquota di cellule e soluzioni senza irradiazione in quanto nessun controllo laser per tenere conto dell'ossidazione dello sfondo all'interno delle cellule. Durante l'esecuzione del campione successivo, centrifugare il primo campione e rimescolare il pellet in 100 microlitri di un appropriato tampone dilisi cellulare. Quindi, trasferire il campione su un tubo di microcentrifugo per il congelamento flash in azoto liquido.
Al termine dell'esecuzione di tutti i campioni, smontare il sistema di flusso e scartare i tubi di silice usati. Quindi, pulire tutte le altre connessioni per sonicazione per un'ora in una soluzione di metanolo al 50% d'acqua al 50%. Dopo aver isolato e digerito le proteine dal lisato cellulare secondo protocolli standard, analizzare il lisato cellulare digerito secondo i protocolli LCMS tandem standard per localizzare il prozio di modifica FPOP a livello di prozio.
Quindi, caricare i dati in un programma software di analisi proteica appropriato e analizzare i dati su un database proteico pertinente e l'enzima digest pertinente. Una volta terminata la ricerca dei file, calcolare l'estensione dell'ossidazione FPOP sulla proteina di interesse. L'imaging a fluorescenza di immagini impilate ortogonali YZ mostra una chiara separazione del tampone di suoneria dalla soluzione cellulare mentre scorre oltre la finestra di irradiazione laser.
È possibile generare mappe di calore medie tridimensionali del buffer di fasa o della soluzione cellulare per illustrare la minima miscelazione delle due soluzioni. L'uso del sistema di flusso a singola cellula aumenta il numero di proteine modificate ossidativamente di 13 volte. Per confermare la modifica delle proteine di interesse all'interno delle cellule intatte, l'imaging a fluorescenza può essere eseguito a seguito del trattamento del perossido di idrogeno e dell'irradiazione.
Usando la spettrometria di massa tandem, queste modifiche possono essere ulteriormente localizzate in aminoacidi specifici su una proteina. Lo spostamento osservato in questo cromatogramma ionica estratto si traduce nel cambiamento di idrofobicità causato dalla meionina ossidata nel peptide modificato. Il confronto dell'actina etichettata in cella mediante impronta in vitro rivela livelli simili di ossidazione, indicando che l'actina ha un'accessibilità solvente simile sia per gli studi in cella che in vitro.
Inoltre, il confronto dell'estensione della rapida ossidazione fotochimica della proteina di interesse modifica l'accessibilità del solvente, i residui etichettati calcolati da due strutture cristalline actina dimostrano che l'ossidazione fotochimica veloce in cella della proteina di interesse sonda efficacemente l'accessibilità del solvente della proteina monomerica. Ci sono diversi passaggi aggiuntivi che si possono fare per aumentare il rilevamento delle più basse abbondanti modifiche FPOP, tra cui cromatografia 2D, frazionamento subcellulare e tecniche di multiplexing proteomica. Con l'uso dell'FPOP in-cell, ora possiamo eseguire la biologia proteomiostrutturale per collegare meglio le strutture proteiche con la funzione cellulare.
A causa della lunghezza d'onda di 248 nanometri richiesta per fpop, assicurarsi di indossare sempre occhiali protettivi UV e indumenti adeguati per evitare un'esposizione involontaria a radiazioni riflesse o sparse.
