Внутриклеточный FPOP в сочетании с масс-спектрометрией является мощным новым методом, используемым для изучения белковых белковых взаимодействий и структурных изменений белка в живых клетках. С в-клеток FPOP, вам не нужно изолировать белки, представляющие интерес, но может скорее изучить их в их родной среде. Это особенно полезно для мембранных белков.
С помощью этого метода, вы можете изучить изменения в структуре и белковых взаимодействий в различных заболеваний, в том числе рака и генетических расстройств, так что вы можете лучше понять и охарактеризовать их. Чтобы начать сборку системы потока, используйте камень расщепления, чтобы сократить сплавленные трубы кремнезема до соответствующих размеров. Затем поместите шесть небольших цилиндрических магнитов в один 500 микролитровый шприц и заполните шприц, второй 500 микролитровый шприц и два пятими миллилитровых шприца с буфером оболочки.
После удаления воздуха, поместите шприцы на шприц насоса и затянуть пробку насоса шприца так, что сотовый шприц имеет примерно 50 микролитров осталось, когда двигатель киосков. Используя адаптер приманки, подключите ручной клапан к каждому шприцу и соберите трубы кремнезема, как показано на иллюстрации, убедившись, что нить клетки плюс перекись водорода кремнезема линии через крест и вставить его непосредственно в 450 ID кремнезема линии. Когда все трубки были подключены, положение системы потока рядом с лазером и использовать зажигалку, чтобы сжечь кремнезема покрытие на 450 микрометров внутреннего диаметра трубки, чтобы сделать окно для лазерного облучения.
Поместите магнитный мешалку над клеточным шприцем, содержащим шесть магнитов, и установите шприц-насос до 492,4 микролитров в минуту для окончательной скорости потока 1083,3 микролитров в минуту. Поток буфера через систему три раза, чтобы промыть систему, проверяя каждое соединение на любые утечки. Используйте выпуклые линзы, чтобы сосредоточить excimer лазера на кремнезема труб.
Чтобы проверить окно облучения, поместите небольшой лист бумаги за трубами кремнезема и включите лазер. Затем измерьте область, сгоревшую от облучения, и используйте окно облучения и скорость потока для расчета необходимой частоты лазера, чтобы получить фракцию исключения нуля. Чтобы собрать клетки для процедуры, мыть клетки от 70 до 90%confluent T175 колбы культуры с соответствующим содержанием соли культуры клеток класса.
Переусердствов клетки в 10 миллилитров буфера для подсчета и сбора клеток центрифугации. Очень важно подсчитать ячейки, чтобы убедиться, что они достаточно для анализа вниз по течению, но не слишком много, чтобы заставить их агрегировать и засорить систему потока. Затем повторное увеличение клеток в два раза от 10 до шестой клетки на миллилитр концентрации буфера оболочки и aliquot клетки в один 500 микролитр объем на образец.
Для в-клеток FPOP, заполнить два пятими миллилитровых шприцев со свежей оболочки буфера, 500 микролитр шприц, содержащий магниты с одной алицита клеток, и окончательный 500 микролитр шприц со свежеприготовленным 200 миллимолярной перекиси водорода. Включите магнитный мешалка и всплеск в 220 микролитров диметилового сульфоксида до одной алициты куанч. После нежного смешивания поместите утолить за системой потока, чтобы собрать облученные образцы и включить лазер.
Через семь секунд включите систему потока. Как только образец закончит течь, выключите лазер и аккуратно смешайте утолить с собранным образцом. Затем заполните все четыре шприца свежим буфером и промыть буфер через систему потока.
После того, как система закончит промывку, повторите процедуру с новой алицита клеток и растворов без облучения, как нет лазерного контроля для учета фонового окисления в клетках. В то время как следующий образец работает, центрифуза первый образец и повторно гранулы в 100 микролитров соответствующего буфера лиза клетки. Затем перенесите образец в микроцентрифугную трубку для флэш-замораживания в жидком азоте.
Когда все образцы закончили работать, разобрать систему потока и отказаться от использованных труб кремнезема. Затем очистите все остальные соединения с помощью sonication в течение одного часа в 50%water 50%метанол раствор. После изоляции и переваривания белков из клетки лисат в соответствии со стандартными протоколами, анализировать переваренные клетки лисат в соответствии со стандартным тандемом LCMS протоколов для локализации модификации FPOP протиум-широкий.
Затем загрузите данные в соответствующую программу анализа белка и проанализируйте данные с соответствующей базой данных белков и соответствующим ферментом дайджеста. Как только файлы будут закончены поиск, рассчитать степень Окисления FPOP на белок интереса. Флуоресценция изображения ортогональных изображений, сложенных Y, показывает четкое отделение буфера оболочки от клеточного раствора, когда он проходит мимо окна лазерного облучения.
Трехмерные средние тепловые карты буфера оболочки или клеточного раствора могут быть созданы, чтобы проиллюстрировать минимальное смешивание этих двух решений. Использование одноклеточной системы потока увеличивает количество окислительно модифицированных белков в 13 раз. Для подтверждения модификации белков, представляющих интерес в нетронутых клетках, флуоресценция изображения могут быть выполнены после лечения перекиси водорода и облучения.
Используя тандемную масс-спектрометрию, эти модификации могут быть дополнительно локализованы на специфические аминокислоты на белке. Сдвиг, наблюдаемый в этой извлеченной ионные хроматограммы переводится как изменение гидрофобности, вызванное окисленного метамфетамина в модифицированном пептиде. Сравнение в клетке помечены актин в пробирке след показывает аналогичные уровни окисления, что свидетельствует о том, что актин имеет аналогичную доступность растворителя для внутриклеточных и в пробирке исследований.
Далее, сравнение степени быстрого фотохимического окисления белка процентных модификаций с доступностью растворителя, помеченные остатки, рассчитанные из двух актиных кристаллических структур, показывает, что в-клеточном быстром фотохимическом окислению белка интереса эффективно зондирует растворительную доступность мономерного белка. Есть несколько дополнительных шагов, которые можно предпринять, чтобы увеличить обнаружение более низких обильных модификаций FPOP, включая 2D хроматографию, субклеточную фракциацию и методы мультиплексирования протеомика. С использованием в-клеток FPOP, теперь мы можем выполнять протеомиоструктурной биологии, чтобы лучше соединить структуры белка с клеточной функцией.
Из-за 248 нанометров длины волны, необходимых для FPOP, не забудьте всегда носить УФ защитные очки и правильную одежду, чтобы избежать непреднамеренного воздействия отраженного или рассеянного излучения.
