질량 분석과 결합된 세포 내 FPOP는 살아있는 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 구조변경을 공부하는 데 사용되는 강력한 새로운 기술입니다. 세포 내 FPOP를 사용하면 관심있는 단백질을 분리 할 필요가 없지만 자신의 모국 환경에서 연구 할 수 있습니다. 이것은 막 단백질에 특히 도움이 됩니다.
이 방법을 사용하면 암 및 유전 질환을 포함한 다양한 질병에서 구조 및 단백질 단백질 상호 작용의 변화를 연구할 수 있으므로 더 잘 이해하고 특성화 할 수 있습니다. 유동 시스템의 조립을 시작하려면, 적절한 크기로 융합 실리카 튜브를 잘라 분열 돌을 사용합니다. 다음으로, 작은 원통형 자석 6개를 500 마이크로리터 주사기에 놓고 주사기, 두 번째 500 마이크로리터 주사기, 시스 버퍼로 5밀리리터 주사기를 채웁니다.
공기를 제거 한 후 주사기 펌프에 주사기를 놓고 주사기 펌프 스토퍼를 조여 서 전지 주사기가 모터 노점 때 약 50 마이크로 리터가 남게합니다. 루어 어댑터를 사용하여 수동 밸브를 각 주사기에 연결하고 그림대로 실리카 튜브를 조립하여 전지와 과산화수소 실리카 라인을 십자가를 통해 스레드하고 450 ID 실리카 라인에 직접 삽입하십시오. 모든 튜브가 연결되면, 레이저 옆에 흐름 시스템을 배치하고 레이저 조사를위한 창을 만들기 위해 450 마이크로 미터 내부 직경 튜브에 실리카 코팅을 구울 라이터를 사용합니다.
6개의 자석이 들어 있는 세포 주사기 위에 자기 교반기를 놓고 분당 1083.3 마이크로리터의 최종 유량에 대해 주사기 펌프를 분당 492.4 마이크로리터로 설정합니다. 시스템을 세 번 플로우 버퍼를 통해 시스템을 플러시하고 누출에 대한 각 연결을 확인합니다. 볼록 렌즈를 사용하여 엑시머 레이저를 실리카 튜브에 집중시하십시오.
조사 창을 테스트하려면 실리카 튜브 뒤에 작은 종이를 놓고 레이저를 켭니다. 그런 다음, 조사창과 유량에서 연소된 영역을 측정하여 필요한 레이저 주파수를 계산하여 0의 배제 분획을 얻습니다. 시술을 위해 세포를 수집하려면 적절한 세포 배양 등급염 용액으로 70 ~ 90 %의 수렴 T175 플라스크 배양 배양에서 세포를 세척하십시오.
계산을 위한 완충의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 원심분리에 의하여 세포를 수집합니다. 셀을 계산하여 다운스트림 분석을 위해 충분하지만 흐름 시스템을 집계하고 막히도록 너무 많지는 않습니다. 그런 다음 칼집 완충 농도의 밀리리터 당 두 번 10에서 여섯 번째 세포로 세포를 다시 중단하고 시료 당 500 마이크로 리터 부피로 세포를 알리쿼트합니다.
세포 내 FPOP의 경우, 신선한 칼집 버퍼로 두 개의 5 밀리리터 주사기를 채우고, 자석을 포함하는 500 마이크로 리터 주사기와 1 개의 알리쿼트가 있는 500 마이크로 리터 주사기, 신선하게 준비된 200 밀리마일라 수소 과산화수소가있는 최종 500 마이크로 리터 주사기를 채웁니다. 220 마이크로리터의 디메틸 설프리산화물에서 자기 교반기와 스파이크를 1개의 알리쿼트에 넣고 담금질의 알리쿼트에 켭니다. 부드러운 혼합 후, 조사 샘플을 수집하고 레이저를 켜기 위해 흐름 시스템 뒤에 담금기를 배치합니다.
7초 후 흐름 시스템을 켭니다. 샘플이 흐르면 레이저를 끄고 수집된 샘플과 담금줄을 부드럽게 섞습니다. 다음으로 주사기 4개 를 모두 새 버퍼로 채우고 흐름 시스템을 통해 버퍼를 플러시합니다.
시스템이 플러싱을 마친 후, 세포 내의 배경 산화를 설명하기 위해 레이저 제어가 없기 때문에 조사없이 세포 및 솔루션의 새로운 알리쿼트와 함께 절차를 반복하십시오. 다음 샘플이 실행되는 동안 원심 분리하고 적절한 세포 리시스 버퍼의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 이어서, 액체 질소에서 플래시 동결을 위해 미세원심분리기 튜브로 샘플을 전송한다.
모든 샘플이 실행완료되면 유동 시스템을 분해하고 사용된 실리카 튜브를 폐기합니다. 그런 다음 50 %의 물 50 % 메탄올 용액에서 1 시간 동안 초음파 처리로 다른 모든 연결을 청소하십시오. 표준 프로토콜에 따라 세포용해에서 단백질을 분리하고 소화한 후, 표준 탠덤 LCMS 프로토콜에 따라 소화된 세포 용양을 분석하여 FPOP 수정 프로티엄 와이드를 국소화한다.
그런 다음 적절한 단백질 분석 소프트웨어 프로그램에 데이터를 로드하고 관련 단백질 데이터베이스 및 관련 소화 효소에 대한 데이터를 분석합니다. 파일 검색이 완료되면 관심 있는 단백질에 대한 FPOP 산화 정도를 계산합니다. 직교 YZ 누적 된 이미지의 형광 화상 진찰은 레이저 조사 창을 지나 흐르는 세포 용액에서 칼집 버퍼의 명확한 분리를 보여줍니다.
칼집 버퍼 또는 셀 용액의 3차원 평균 열 맵을 생성하여 두 솔루션의 최소 혼합을 설명할 수 있다. 단일 세포 유량 시스템의 사용은 산화적으로 변형된 단백질의 수를 13배 증가시킨다. 그대로 세포 내에서 관심있는 단백질의 변형을 확인하기 위해, 형광 화상 진찰은 과산화수소 치료 및 조사 에 따라 수행 될 수있다.
탠덤 질량 분석법을 사용하여 이러한 수정은 단백질의 특정 아미노산에 더 국한될 수 있습니다. 이 추출된 이온 크로마토그램에서 관찰된 변화는 수정된 펩타이드에서 산화된 메티오닌에 의한 소수성 변화를 변환한다. 체외 내 발자국에 의해 세포 내 표지된 액틴을 비교하면 유사한 수준의 산화가 드러나며, 이는 액틴이 세포 내 및 체외 연구 모두에 유사한 용매 접근성을 가지고 있음을 나타냅니다.
또한, 용매 접근성에 대한 이자 수정의 단백질의 빠른 광화학적 산화의 정도를 비교하여, 2개의 액틴 결정 구조로부터 계산된 라벨이 부착된 잔류물은 관심 있는 단백질의 세포 내 빠른 광화학 산화가 단황 단백질의 용매 접근성을 효율적으로 탐구한다는 것을 보여준다. 2D 크로마토그래피, 세포 외 분획 및 프로테오믹스 멀티플렉스 기술을 포함하여 낮은 풍부한 FPOP 수정의 검출을 높이기 위해 취할 수 있는 몇 가지 추가 단계가 있다. 세포 내 FPOP의 사용으로, 우리는 지금 세포 기능과 단백질 구조를 더 잘 연결하기 위하여 proteomyo구조 생물학을 능력을 발휘할 수 있습니다.
FPOP에 필요한 248 나노미터 파장으로 인해 반사되거나 산란된 방사선에 의도하지 않은 노출을 피하기 위해 항상 UV 보호 고글과 적절한 옷을 착용해야합니다.
