Utilizando nuestro protocolo, la multicapa de las diluciones de bioenlaces similares a líquidos no sólo promueve una dispersión homogénea de las células encapsuladas, sino que también mantiene un entorno de bioenlatado adecuado para células. Utilizamos la tensión interfacial para detener la sedimentación de las células encapsuladas dentro del depósito de bioenlaces, evitando la alta carga de tensión de cizallamiento a las células durante la impresión de extrusión. Usando esta tecnología, podemos generar construcciones de tejido 3D con una distribución celular homogénea, proporcionando un molde de tejido in vitro funcional para su uso en estudios de medicina de detección y regeneración de fármacos.
Al preparar el bioenlaz, es importante prestar atención a la temperatura experimental y al procedimiento de carga de higrogel, ya que estos factores pueden afectar a la calidad de la tinta. Antes de comenzar la preparación, utilice unidades de filtro de jeringa de 0,22 micrómetros para esterilizar todos los materiales y disuelva la gelatina a una concentración final del 10% en PBS de 50 grados celsius en un gabinete de seguridad biológica. Añadir anhídrido metacrílico a la solución de gelatina a una proporción de 0,6 a una proporción de peso con agitación lenta durante al menos una hora a 50 grados centígrados.
Al final de la incubación, transfiera la solución mixta a un tubo estéril de 50 mililitros y separe la solución en capas por centrifugación. Recoger la capa superior de GelMA, y diluir la solución recogida con dos volúmenes de 40 a 50 grados celsius desionizado. Dialyze la solución GelMA con una membrana de diálisis de peso molecular de 12 a 14 kilos de kilos de unión contra el agua desionizada durante cinco a siete días a 40 a 50 grados centígrados, cambiando el agua dos veces al día.
Al final de la diálisis, congele la solución De GelMA a menos 80 grados Centígrados durante la noche. A continuación, liofilice la solución de GelMA durante tres a cinco días en un secador de congelación a menos 45 grados centígrados y 0,2 milibares de presión. A continuación, disolver el GelMA liofilizado en PBS complementado con 10%suero bovino fetal, 25 HEPES milimolar, y 0.5%fotoiniciador.
Para obtener los bioenergidos GelMA de fibroína de seda, mezcle la solución GelMA con diferentes volúmenes de solución inicial de fibroína de seda y diferentes volúmenes de PBS como se sugiere en la tabla. Una vez preparados todos los bioenergidos, sonicar la solución durante 10 a 20 minutos. Mientras las tintas se sonican, recoja las células de un cultivo celular NIH/3T3 confluente del 80%en un tubo cónico de 15 mililitros por solución de bioenergiente, y pelete las células por centrifugación.
A continuación, aspirar cuidadosamente los sobrenadantes y resuspender las células en cada tubo con dos mililitros de bioenlazo a una vez 10 a las seis células por mililitro de concentración de solución de bioenlazo. Para cargar el bioenergía para imprimir, añada 400 microlitros de fibroína de seda cargada de células 0,5 GelMA a la capa inferior de una jeringa de dos mililitros. Coloque la jeringa en un baño de agua helada de cero grados celsius durante cinco minutos para transformar el bioenergiente de capa inferior en un estado de gel antes de cargar 400 microlitros de fibroína de seda cargada de células 0,75 GelMA bioink sobre la capa de fibroína de seda 0.5 GelMA.
A continuación, devuelva la jeringa al baño de hielo durante cinco minutos, continuando añadiendo cada concentración adicional de bioenergiendo cargado de células a la jeringa de la misma manera. Cuando se haya logrado un sistema de bioenlace multicapa con diferentes concentraciones de fibroína de seda dentro de las diferentes capas, recalentar el bioenlace en una incubadora de 37 grados Celsius durante 30 minutos. Al final de la incubación, cargue una boquilla de impresión de calibre 27 en la jeringa y ajuste la velocidad de flujo a 50 microlitros por minuto, la velocidad de movimiento de la boquilla a dos mililitros por segundo y la altura de la boquilla a un milímetro.
A continuación, imprima la construcción de tejido de una manera de extrusión utilizando una bioimpresora hecha a medida a temperatura ambiente, y reenrosque la construcción de tejido bioimpreso con 365 nanómetros de luz ultravioleta durante 40 segundos a 800 milivatios. A continuación, cultivo de la construcción de tejido reticulado en DMEM complementado con 10%suero bovino fetal y 1%penicilina-estreptomicina en una incubadora de cultivo celular, cambiando el medio cada ocho horas durante los dos primeros días y cada dos a tres días a partir de entonces. En este análisis representativo, a medida que avanzaba el procedimiento de bioimpresión, la densidad de células en los pozos objetivo disminuyó en todos los grupos.
En el grupo GelMA de fibroína cero de seda, aproximadamente el 70% de las células se depositaron en la capa inferior. En el fibroin de seda un grupo GelMA, aproximadamente el 40% de las células fueron depositadas en la capa inferior, y aproximadamente el 5% de las células fueron depositadas en la capa superior. En el grupo GelMA multicapa de fibroína de seda, la deposición de células encapsuladas era más homogénea que la de los grupos de control.
La parte más crítica de este protocolo es la carga de las multicapas de bioenlaces SF-GelMA. Este protocolo se puede aplicar a otros análisis de bioimpresión de extrusión que utilicen bioenergientes similares a líquidos.
